概要：脂質納米顆粒（LNPs）是一種具有均勻脂質核的脂囊泡，被廣泛應用于小分子藥物和核酸輸送，最近因為在COVID-19 mRNA疫苗遞送平臺取得的顯著成功引起了廣泛的關注。然而，mRNA誘導的短暫蛋白表達的應用并不僅僅用于傳染性疾病的疫苗領域，也為癌癥疫苗、蛋白質替代療法和罕見遺傳疾病的基因編輯組件提供了新的途徑。然而，未包覆的mRNA本身并不穩定，很容易由于核酸酶和自水解快速降解。經LNPs包覆的mRNA可以免受細胞外核糖核酸酶的影響，并有助于細胞內mRNA的遞送。在這(zhe)篇(pian)文(wen)章(zhang)中，我(wo)們將討論RNA遞(di)送(song)(song)所(suo)使(shi)用LNPs的(de)核(he)心特(te)征。本文(wen)將聚焦于mRNA遞(di)送(song)(song)用LNPs；然而，也相應地(di)列舉了siRNA-LNP遞(di)送(song)(song)的(de)例子，以突出(chu)核(he)酸(suan)結(jie)構造成的(de)共性和差(cha)異。首先，將介(jie)紹(shao)LNPs的(de)(de)(de)(de)概念(nian)，利用(yong)核(he)酸(suan)作為(wei)治療藥物(wu)的(de)(de)(de)(de)優點和(he)(he)(he)缺點，以(yi)(yi)及(ji)LNPs分(fen)(fen)子(zi)構(gou)成的(de)(de)(de)(de)一般推理；同時簡要介(jie)紹(shao)了(le)臨床上基于LNPs的(de)(de)(de)(de)核(he)酸(suan)治療的(de)(de)(de)(de)最新成功經驗。其(qi)次(ci)，闡述了(le)LNP自組裝的(de)(de)(de)(de)理論和(he)(he)(he)方(fang)法(fa)。所有(you)制備方(fang)法(fa)的(de)(de)(de)(de)共同理念(nian)是誘導核(he)酸(suan)和(he)(he)(he)帶電(dian)(dian)脂質(zhi)(zhi)之間的(de)(de)(de)(de)靜電(dian)(dian)相(xiang)互作用(yong)，并通過疏水(shui)作用(yong)促進(jin)(jin)納米(mi)顆粒的(de)(de)(de)(de)生長。第三，根據基本性質(zhi)(zhi)和(he)(he)(he)用(yong)途對LNP進(jin)(jin)行成分(fen)(fen)分(fen)(fen)解，包(bao)(bao)括公認的(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)子(zi)設計標準、商(shang)業來源，對細胞(bao)內運輸的(de)(de)(de)(de)影(ying)(ying)響，以(yi)(yi)及(ji)對LNPs性能(neng)的(de)(de)(de)(de)貢獻。LNPs的(de)(de)(de)(de)關鍵成分(fen)(fen)之一是啟動與(yu)(yu)內吞體膜的(de)(de)(de)(de)靜電(dian)(dian)結(jie)(jie)合(he)、并促進(jin)(jin)胞(bao)質(zhi)(zhi)釋放的(de)(de)(de)(de)可電(dian)(dian)離(li)脂質(zhi)(zhi)；然而，其(qi)他脂質(zhi)(zhi)成分(fen)(fen)的(de)(de)(de)(de)作用(yong)也不應忽視，因為(wei)它(ta)們與(yu)(yu)LNPs的(de)(de)(de)(de)穩定(ding)性、間隙(xi)和(he)(he)(he)分(fen)(fen)布密切相(xiang)關。第四(si)，從整體上回顧了(le)對RNA遞送有(you)重要影(ying)(ying)響的(de)(de)(de)(de)LNP結(jie)(jie)構(gou)屬(shu)性，包(bao)(bao)括LNP的(de)(de)(de)(de)尺寸、電(dian)(dian)荷、內部結(jie)(jie)構(gou)、脂質(zhi)(zhi)封裝、脂膜水(shui)合(he)作用(yong)、穩定(ding)性和(he)(he)(he)對生物(wu)大(da)分(fen)(fen)子(zi)的(de)(de)(de)(de)親(qin)和(he)(he)(he)性；還將討論這些(xie)屬(shu)性的(de)(de)(de)(de)檢測技術以(yi)(yi)及(ji)調控(kong)方(fang)法(fa)。最后(hou)，展望了(le)RNA療法的未來，并提出了(le)LNP配(pei)方和(he)優化領域中存在的一些問題。

1.引言

近年來(lai)，脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)納米顆粒（LNPs）顯(xian)示其(qi)在RNA疫(yi)苗(miao)和(he)(he)(he)療(liao)法中(zhong)作為遞(di)送(song)(song)系統的(de)(de)的(de)(de)實用(yong)性。無包覆的(de)(de)RNA是(shi)(shi)一種(zhong)帶(dai)負電(dian)(dian)(dian)荷(he)的(de)(de)親水大(da)分子，由(you)(you)于細(xi)胞(bao)膜(mo)的(de)(de)靜電(dian)(dian)(dian)排斥，很難進入細(xi)胞(bao)，并被(bei)(bei)無所(suo)不在的(de)(de)核糖核酸(suan)(suan)酶(mei)（RNase）迅速降解。因(yin)此，它需要(yao)(yao)一個保護層以增加進入細(xi)胞(bao)內(nei)部機(ji)會。由(you)(you)于細(xi)胞(bao)膜(mo)主要(yao)(yao)由(you)(you)脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)構(gou)成，因(yin)此，使用(yong)脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)體包覆RNA可以使RNA更容(rong)易通(tong)過(guo)細(xi)胞(bao)膜(mo)并將(jiang)其(qi)釋(shi)放到細(xi)胞(bao)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)中(zhong)。為了(le)(le)實現這(zhe)個目(mu)的(de)(de)，脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)體首先需要(yao)(yao)一個帶(dai)正(zheng)電(dian)(dian)(dian)的(de)(de)脂(zhi)粒，可以附著在帶(dai)負電(dian)(dian)(dian)的(de)(de)RNA上。然而(er)，由(you)(you)永久性陽離子脂(zhi)粒組成的(de)(de)脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)體會對帶(dai)負電(dian)(dian)(dian)荷(he)的(de)(de)細(xi)胞(bao)膜(mo)產生(sheng)靜電(dian)(dian)(dian)破(po)壞(huai)從(cong)而(er)引起細(xi)胞(bao)毒性。因(yin)此，脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)結構(gou)被(bei)(bei)進一步改進，通(tong)過(guo)酸(suan)(suan)性內(nei)溶酶(mei)體途徑獲得正(zheng)電(dian)(dian)(dian)荷(he)；LNP成分也(ye)擴展到了(le)(le)結構(gou)脂(zhi)類（模擬(ni)細(xi)胞(bao)膜(mo)并屏(ping)蔽正(zheng)電(dian)(dian)(dian)荷(he)）和(he)(he)(he)聚（乙二醇）-錨定脂(zhi)類（防(fang)止LNPs聚集以及與生(sheng)物環境的(de)(de)副(fu)反(fan)應）。從(cong)FDA批準了(le)(le)首個siRNA-LNP藥物（Onpattro）和(he)(he)(he)mRNA-LNP新冠(guan)疫(yi)苗(miao)（Comirnaty）以及Moderna新冠(guan)疫(yi)苗(miao)的(de)(de)緊急使用(yong)授(shou)權（EUA）等這(zhe)些該(gai)領域(yu)的(de)(de)主要(yao)(yao)監(jian)管里程碑事(shi)件可以明顯(xian)看出，基于LNP的(de)(de)核酸(suan)(suan)遞(di)送(song)(song)方(fang)法是(shi)(shi)安全(quan)的(de)(de)，適用(yong)于各(ge)種(zhong)療(liao)法。然而(er)，目(mu)前還沒有(you)適合所(suo)有(you)疾病的(de)(de)萬能方(fang)案(an)，因(yin)此LNP的(de)(de)優(you)化工作依舊任(ren)重道遠。本文(wen)將(jiang)討論(lun)用(yong)于選擇RNA-LNP遞(di)送(song)(song)脂(zhi)類所(suo)需的(de)(de)主要(yao)(yao)科學和(he)(he)(he)制造概(gai)念(nian)。

2.制備

LNP的(de)制備依賴于自(zi)組(zu)(zu)裝(zhuang)能力(li)，即脂質成(cheng)(cheng)分(fen)(fen)在分(fen)(fen)子(zi)間相(xiang)互(hu)(hu)作用的(de)基礎上自(zi)發(fa)組(zu)(zu)裝(zhuang)成(cheng)(cheng)納米實(shi)體。LNP的(de)形成(cheng)(cheng)從帶負電荷的(de)核酸(suan)(suan)和(he)帶正電荷的(de)脂類(lei)之間的(de)靜電結合開(kai)始。然后，LNPs通過(guo)疏水性和(he)脂質組(zu)(zu)分(fen)(fen)之間相(xiang)互(hu)(hu)作用的(de)范(fan)德華力(li)增長(chang)。由于脂質的(de)多樣性、核酸(suan)(suan)的(de)獨特性及(ji)兩者混合過(guo)程(cheng)的(de)瞬時性，對(dui)自(zi)組(zu)(zu)裝(zhuang)的(de)早期階段及(ji)其對(dui)LNP最終性質的(de)相(xiang)關影(ying)響的(de)表征(zheng)仍然極具挑戰。此外，LNP制造協議至少在兩個方面影(ying)響產品的(de)自(zi)組(zu)(zu)裝(zhuang): LNPs的(de)均勻性和(he)核酸(suan)(suan)負載效(xiao)率。

LNP有(you)多(duo)種制備(bei)方(fang)法(fa)(fa)(fa)，如脂膜泡擠出法(fa)(fa)(fa)、脂膜再(zai)水(shui)化、納米沉淀法(fa)(fa)(fa)和微(wei)流(liu)體混(hun)(hun)(hun)合(he)法(fa)(fa)(fa)。然而(er)(er)，通常的(de)制備(bei)方(fang)法(fa)(fa)(fa)是將(jiang)水(shui)和脂質(zhi)組分快速混(hun)(hun)(hun)合(he)。微(wei)流(liu)控(kong)技術以其良好的(de)重復(fu)性(xing)而(er)(er)成為當前臨(lin)床前研(yan)究(jiu)的(de)首選方(fang)法(fa)(fa)(fa)。新型微(wei)流(liu)控(kong)設備(bei)制造取得的(de)進展使這種方(fang)法(fa)(fa)(fa)更容易實(shi)(shi)現(xian)，采用平行(xing)微(wei)流(liu)體通道或改進的(de)傳統方(fang)法(fa)(fa)(fa)（如移液管混(hun)(hun)(hun)合(he)和t型混(hun)(hun)(hun)合(he)器）等(deng)其他途(tu)徑也可以實(shi)(shi)現(xian)LNPs的(de)高通量制備(bei)。一般來(lai)講，微(wei)流(liu)體混(hun)(hun)(hun)合(he)有(you)利于(yu)將(jiang)親水(shui)性(xing)部分封裝到疏(shu)水(shui)的(de)脂質(zhi)核(he)(he)心(xin)中，但這一過(guo)程(cheng)并不能(neng)嚴格需要(yao)核(he)(he)酸的(de)參與。Kulkarni等(deng)報道，只(zhi)要(yao)脂質(zhi)核(he)(he)心(xin)形成，LNPs可以在T型混(hun)(hun)(hun)合(he)器內與siRNA完成組裝。總的(de)來(lai)說，混(hun)(hun)(hun)合(he)方(fang)式的(de)特性(xing)可能(neng)會(hui)影響LNPs的(de)組裝效率和內部結構，而(er)(er)自(zi)組裝過(guo)程(cheng)的(de)動力(li)學因數則會(hui)決定最終(zhong)的(de)納米結構。

3.配方

3.1陽離子(zi)和可電離脂質

陽離(li)子(zi)脂(zhi)質（CLs）和可電離(li)脂(zhi)質（ILs）通(tong)過靜電相(xiang)互作(zuo)用啟動自組(zu)裝的(de)(de)第一(yi)步。含有(you)CLs的(de)(de)脂(zhi)質體仍(reng)被廣泛用于(yu)核(he)酸(suan)遞送。然而(er)，由于(yu)毒性問題和缺乏體內療效，它們(men)已被對pH敏感(gan)的(de)(de)ILs所取代(dai)。當(dang)被配制成LNPs時(shi)，ILs被設計成在(zai)生理pH下(xia)顯示電中(zhong)性，但(dan)在(zai)酸(suan)性核(he)內體內則表現為(wei)帶正(zheng)電荷。這(zhe)種pH適應的(de)(de)電離(li)性使其功效提升同時(shi)毒性降(jiang)低，從而(er)更適合于(yu)核(he)酸(suan)遞送。這(zhe)些脂(zhi)類通(tong)常占(zhan)配方中(zhong)總脂(zhi)類的(de)(de)30-50%。許(xu)多研究(jiu)致力于(yu)微調ILs的(de)(de)屬性，以進(jin)一(yi)步提高效率，特(te)別是在(zai)難以觸及的(de)(de)組(zu)織(zhi)。CLs和ILs的(de)(de)整體結構可以分(fen)為(wei)三個(ge)部(bu)(bu)分(fen)：（1）頭基、（2）連接體及（3）尾部(bu)(bu)（圖1）。

圖1 CLs和(he)ILs結(jie)構(gou)及組(zu)件（頭基、連接體及尾部(bu)）示意(yi)圖

頭(tou)(tou)(tou)基(ji) ILs的(de)(de)(de)頭(tou)(tou)(tou)基(ji)通(tong)常帶正電荷(he)。頭(tou)(tou)(tou)基(ji)的(de)(de)(de)大小(xiao)和(he)電荷(he)密度對核酸包(bao)覆、LNP穩(wen)定、與細胞膜相互作用以及促進核內體中的(de)(de)(de)釋放有(you)重要作用。ILs也(ye)可(ke)(ke)能(neng)有(you)多個可(ke)(ke)電離(li)的(de)(de)(de)頭(tou)(tou)(tou)基(ji)，盡(jin)管(guan)通(tong)常情況下只有(you)一個。典(dian)型的(de)(de)(de)基(ji)包(bao)括胺（從一級到四級）、胍和(he)雜環群(qun) （見(jian)圖(tu)1）。臨床應用的(de)(de)(de)ILs（DLin-MC3-DMA、SM-102和(he)ALC-0315；見(jian)圖(tu)2）包(bao)含具有(you)pH適應電離(li)性(xing)的(de)(de)(de)叔胺頭(tou)(tou)(tou)基(ji)。ALC-0315和(he)SM-102頭(tou)(tou)(tou)基(ji)中也(ye)含有(you)末端羥基(ji)，可(ke)(ke)以減少頭(tou)(tou)(tou)基(ji)的(de)(de)(de)水合(he)作用，并提(ti)高其(qi)與核酸的(de)(de)(de)氫(qing)鍵作用，可(ke)(ke)能(neng)會提(ti)高轉染能(neng)力。

圖2 特(te)定(ding)ILs結構(gou)及cpKa和cLogP值

連接(jie)(jie)(jie)體(ti)(ti) 連接(jie)(jie)(jie)體(ti)(ti)通常(chang)連接(jie)(jie)(jie)頭基(ji)與尾部，也可(ke)能包含在(zai)(zai)尾部內（SM-102和(he)ALC-0315；見圖2）。連接(jie)(jie)(jie)體(ti)(ti)會(hui)影響(xiang)LNPs的(de)穩定性(xing)(xing)、生(sheng)物(wu)降(jiang)解性(xing)(xing)、細胞毒性(xing)(xing)和(he)轉染效率。在(zai)(zai)CLs和(he)ILs設計中使用的(de)常(chang)用連接(jie)(jie)(jie)器如圖1所示(shi)。ILs可(ke)能包含一(yi)個(ge)或多(duo)個(ge)連接(jie)(jie)(jie)體(ti)(ti)；然而，為(wei)(wei)了便于合成，大多(duo)數(shu)ILs只含有(you)一(yi)種(zhong)類(lei)(lei)型(xing)的(de)連接(jie)(jie)(jie)體(ti)(ti)。連接(jie)(jie)(jie)體(ti)(ti)可(ke)分(fen)為(wei)(wei)不可(ke)生(sheng)物(wu)降(jiang)解型(xing)（如醚類(lei)(lei)和(he)氨基(ji)甲酸酯(zhi)(zhi)類(lei)(lei)）和(he)可(ke)生(sheng)物(wu)降(jiang)解型(xing)（如酯(zhi)(zhi)類(lei)(lei)、酰(xian)胺類(lei)(lei)和(he)硫醇類(lei)(lei)）。生(sheng)物(wu)可(ke)降(jiang)解連接(jie)(jie)(jie)體(ti)(ti)由于可(ke)在(zai)(zai)體(ti)(ti)內被快速清除，通常(chang)被作為(wei)(wei)首選，以確保多(duo)次給藥并減(jian)少潛在(zai)(zai)的(de)副作用。值得注意的(de)是，DLin-MC3-DMA，ALC-0315和(he)SM-102都(dou)含有(you)酯(zhi)(zhi)類(lei)(lei)連接(jie)(jie)(jie)體(ti)(ti)。對于SM-102，酯(zhi)(zhi)基(ji)團周圍的(de)修飾被證(zheng)實會(hui)影響(xiang)LNPs的(de)清除、穩定性(xing)(xing)和(he)轉染效率。

尾(wei)(wei)部(bu)(bu) 疏水(shui)性(xing)的尾(wei)(wei)部(bu)(bu)會影響(xiang)pKa、親(qin)脂性(xing)、流動(dong)性(xing)和(he)(he)融合性(xing)，從而影響(xiang)納(na)米(mi)顆粒的形(xing)成(cheng)和(he)(he)效力。通(tong)常，一個IL包含(han)1到4個由(you)8到20個碳原(yuan)子組成(cheng)的飽(bao)和(he)(he)或不(bu)飽(bao)和(he)(he)的疏水(shui)性(xing)尾(wei)(wei)部(bu)(bu)。不(bu)飽(bao)和(he)(he)程度(du)已被證明通(tong)過(guo)調節(jie)膜(mo)不(bu)穩定相關方面影響(xiang)核酸的遞送。DLin-MC3-DMA有(you)兩條(tiao)亞油基尾(wei)(wei)部(bu)(bu)，而ALC-0315和(he)(he)SM-102包含(han)兩個假定為(wei)錐形(xing)的分叉飽(bao)和(he)(he)尾(wei)(wei)部(bu)(bu)，有(you)助(zhu)于對核內體膜(mo)的去穩定作用和(he)(he)核酸在細胞溶質(zhi)的釋放。

ILs可以(yi)被(bei)看作是(shi)多組分分子，其(qi)中(zhong)的(de)(de)(de)每個(ge)(ge)部分都需要被(bei)精確設計，以(yi)便安全(quan)、高(gao)效(xiao)地包覆和(he)(he)遞送(song)(song)核(he)酸。從整(zheng)體上理(li)解ILs的(de)(de)(de)特(te)性(xing)也有助于(yu)設計下一(yi)代ILs。這些性(xing)質(zhi)之一(yi)是(shi)計算出的(de)(de)(de)ILs的(de)(de)(de)pKa（cpKa），可以(yi)很容(rong)易(yi)地在(zai)硅中(zhong)確定(ding)。常見(jian)ILs的(de)(de)(de)cpKa值(zhi)(zhi)(zhi)在(zai)9到10.5之間（圖2）。最(zui)(zui)近的(de)(de)(de)一(yi)項研究表(biao)明，cpKa極度(du)接(jie)近IL的(de)(de)(de)實(shi)際(ji)pKa. ILs的(de)(de)(de)cpKa似(si)乎影響相應LNP配(pei)方的(de)(de)(de)整(zheng)體pKa，這樣當(dang)IL 的(de)(de)(de)cpKa大約(yue)是(shi)8.5−10.5時(shi)(shi)，LNP的(de)(de)(de)pKa值(zhi)(zhi)(zhi)約(yue)為(wei)6−7。IL的(de)(de)(de)cpKa和(he)(he)LNP的(de)(de)(de)pKa之間的(de)(de)(de)差值(zhi)(zhi)(zhi)似(si)乎是(shi)固定(ding)的(de)(de)(de)，約(yue)等(deng)于(yu)2 - 4個(ge)(ge)單位。因(yin)此(ci)，cpKa可以(yi)作為(wei)新ILs產品(pin)設計的(de)(de)(de)指導工具。ILs的(de)(de)(de)另外(wai)兩個(ge)(ge)不太被(bei)關注的(de)(de)(de)性(xing)質(zhi)是(shi)cLogP和(he)(he)cLogD值(zhi)(zhi)(zhi)，它們分別代表(biao)分子在(zai)非電(dian)離態(tai)和(he)(he)電(dian)離態(tai)下的(de)(de)(de)親(qin)(qin)油(you)性(xing)。在(zai)最(zui)(zui)近的(de)(de)(de)一(yi)項研究中(zhong)，Rajappan等(deng)考(kao)察了pKa、cpKa和(he)(he)cLogD對LNPs遞送(song)(song)siRNA的(de)(de)(de)影響，發現(xian)cLogD在(zai)10 - 14范圍內的(de)(de)(de)脂質(zhi)效(xiao)果最(zui)(zui)好(hao)。因(yin)為(wei)一(yi)些常見(jian)的(de)(de)(de)ILs的(de)(de)(de)cLogP值(zhi)(zhi)(zhi)在(zai)15−20范圍內 （圖2），在(zai)設計下一(yi)代ILs時(shi)(shi)也應考(kao)慮其(qi)親(qin)(qin)油(you)性(xing)性(xing)。由(you)于(yu)電(dian)離度(du)（cpKa）和(he)(he)親(qin)(qin)油(you)性(xing)（cLogP） IL可以(yi)影響從最(zui)(zui)初的(de)(de)(de)與(yu)核(he)酸形(xing)成(cheng)(cheng)(cheng)復雜結構到最(zui)(zui)終納(na)米粒子形(xing)成(cheng)(cheng)(cheng)以(yi)及(ji)核(he)酸遞送(song)(song)的(de)(de)(de)整(zheng)個(ge)(ge)流程，在(zai)合成(cheng)(cheng)(cheng)IL前同時(shi)(shi)考(kao)慮這兩個(ge)(ge)參(can)數可能(neng)會極大的(de)(de)(de)推動(dong)高(gao)效(xiao)IL的(de)(de)(de)發現(xian)。不過，需要更多的(de)(de)(de)研究來印證(zheng)這一(yi)觀(guan)點。

除了傳統的(de)(de)CLs和(he)ILs外，還有一(yi)(yi)些兩(liang)性離子(zi)脂類的(de)(de)例子(zi)。在最(zui)近的(de)(de)一(yi)(yi)項研(yan)(yan)究中，Liu等人(ren)合成(cheng)了一(yi)(yi)個名為iPhos的(de)(de)超過500種兩(liang)性離子(zi)脂質的(de)(de)庫。這些iPhos由一(yi)(yi)個胺(an)基(ji)、短疏水性尾(wei)部和(he)一(yi)(yi)個磷酸(suan)鹽(yan)連接體組成(cheng)。研(yan)(yan)究認為，帶負電荷的(de)(de)磷酸(suan)基(ji)促進了膜融合，并導致核(he)內體釋(shi)放。最(zui)優的(de)(de)9A1P9的(de)(de)各種配方可以優先將(jiang)目標(biao)核(he)酸(suan)輸(shu)送(song)到肝臟和(he)肺(fei)部。

綜上(shang)所述，ILs各部分(fen)的性(xing)質影響整體配方和(he)生物學特(te)性(xing)。過去50年(nian)間，為(wei)設計出理想的IL已經(jing)有(you)了許多系統的研(yan)究。其中一(yi)些ILs已經(jing)被FDA批準用于基(ji)因制(zhi)劑的遞送。然而(er)，設計能夠(gou)在非肝靶上(shang)高效(xiao)無毒地(di)輸送不同類型的基(ji)因制(zhi)劑的ILs仍需大量研(yan)究。對ILs合成(cheng)有(you)更多興趣(qu)的讀者可以參考(kao)一(yi)篇優(you)秀的相關綜述。

3.2固醇類

圖3 LNP配方中使用的固醇（綠色）、磷(lin)脂（藍色）和PEG脂質(zhi) （紅(hong)色）舉例

3.3磷脂(zhi)類

磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)有助于(yu)(yu)(yu)核(he)(he)酸的(de)(de)(de)(de)封裝和(he)LNPs穩(wen)定(ding)性(xing)的(de)(de)(de)(de)提(ti)高(gao)(gao)。與其他脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)類(lei)成(cheng)(cheng)分相(xiang)比，它們的(de)(de)(de)(de)研(yan)(yan)究(jiu)相(xiang)對(dui)較少，通常只占配(pei)方中(zhong)總脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)類(lei)的(de)(de)(de)(de)10 - 20%。磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)因為(wei)可(ke)以自(zi)發地組織成(cheng)(cheng)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)雙分子(zi)層(ceng)，并且具有較高(gao)(gao)的(de)(de)(de)(de)相(xiang)變(bian)溫度從而(er)確保LNPs的(de)(de)(de)(de)膜穩(wen)定(ding)性(xing)而(er)被(bei)用(yong)(yong)作(zuo)結(jie)構(gou)(gou)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)。磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)位于(yu)(yu)(yu)LNPs的(de)(de)(de)(de)外圍，就像(xiang)細(xi)胞(bao)膜一樣。這些脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)類(lei)通常是半合成(cheng)(cheng)的(de)(de)(de)(de)，例如(ru)，磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酰膽堿通常來自(zi)蛋黃和(he)大豆等天(tian)然(ran)來源，可(ke)以通過化學(xue)修飾使(shi)其包含脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)肪酸尾部。二硬脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酰磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酰膽堿 （DSPC）（見圖(tu)3）是一種臨床(chuang)批準的(de)(de)(de)(de)LNPs結(jie)構(gou)(gou)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)，用(yong)(yong)于(yu)(yu)(yu)如(ru)siRNA治療（Onpattro）和(he)針(zhen)對(dui)SARS-CoV-2的(de)(de)(de)(de)mRNA疫苗。DSPC在(zai)結(jie)構(gou)(gou)上(shang)由磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酰膽堿頭基(ji)和(he)兩個飽和(he)18碳尾組成(cheng)(cheng)，形(xing)成(cheng)(cheng)一個緊(jin)密(mi)堆(dui)積的(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)雙分子(zi)層(ceng)。在(zai)LNPs中(zhong)，它主要(yao)位于(yu)(yu)(yu)納米(mi)顆粒表面，同(tong)時在(zai)納米(mi)顆粒核(he)(he)中(zhong)少量存在(zai)。二油酰磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酰乙醇(chun)胺(an)（DOPE）是另一種經常用(yong)(yong)于(yu)(yu)(yu)LNPs臨床(chuang)前研(yan)(yan)究(jiu)的(de)(de)(de)(de)磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)。由于(yu)(yu)(yu)尾部不飽和(he)，DOPE不僅形(xing)成(cheng)(cheng)流動(dong)性(xing)更好的(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)層(ceng)，而(er)且具有形(xing)成(cheng)(cheng)六邊形(xing)II （HII）相(xiang)結(jie)構(gou)(gou)的(de)(de)(de)(de)內在(zai)能(neng)力。HII相(xiang)結(jie)構(gou)(gou)被(bei)認(ren)為(wei)能(neng)促進(jin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)膜與核(he)(he)內體膜的(de)(de)(de)(de)膜融(rong)合，進(jin)而(er)使(shi)核(he)(he)酸制劑在(zai)胞(bao)質(zhi)(zhi)(zhi)內釋放。多(duo)項研(yan)(yan)究(jiu)表明(ming)，與DSPC相(xiang)比，DOPE可(ke)以提(ti)高(gao)(gao)率(lv)磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)基(ji)LNPs中(zhong)RNA的(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)染效率(lv)。近期，Zhang等人報道稱，DOPE可(ke)導致(zhi)C12-200 LNPs在(zai)肝臟(zang)內的(de)(de)(de)(de)聚(ju)集，而(er)DSPC會(hui)導致(zhi)靜脈給藥時脾積聚(ju)，證明(ming)了結(jie)構(gou)(gou)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)對(dui)LNP生物分布的(de)(de)(de)(de)影響(xiang)。我們還發現，用(yong)(yong)天(tian)然(ran)糖脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)替(ti)代(dai)MC3基(ji)LNPs中(zhong)的(de)(de)(de)(de)DSPC會(hui)影響(xiang)mRNA轉(zhuan)染，來自(zi)植(zhi)物的(de)(de)(de)(de)膜脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)--高(gao)(gao)絲(si)氨酸（DGTS）（見圖(tu)3），可(ke)以根據給藥途徑表現出(chu)不同(tong)的(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)染效率(lv)。總之，這些研(yan)(yan)究(jiu)突出(chu)了結(jie)構(gou)(gou)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)在(zai)LNPs介導的(de)(de)(de)(de)RNA遞送中(zhong)的(de)(de)(de)(de)重要(yao)性(xing)。

3.4嵌(qian)PEG脂質

嵌PEG脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)（PEG-lipids，見圖3）是控制LNPs半衰期和(he)(he)細(xi)(xi)(xi)胞攝入(ru)的(de)(de)(de)(de)一(yi)個(ge)重(zhong)要(yao)組成部(bu)分(fen)。在LNP組裝過程中，PEG鏈(lian)由于(yu)(yu)其(qi)(qi)親水性和(he)(he)大體(ti)(ti)積(ji)而位(wei)于(yu)(yu)納米(mi)顆粒(li)(li)的(de)(de)(de)(de)外殼中。與(yu)(yu)其(qi)(qi)他納米(mi)載體(ti)(ti)一(yi)樣，PEG為LNPs提供了外部(bu)聚合(he)(he)(he)(he)物層(ceng)，以阻(zu)礙血清(qing)蛋白和(he)(he)單核吞噬細(xi)(xi)(xi)胞系統(tong)的(de)(de)(de)(de)吸(xi)附，延長(chang)體(ti)(ti)內循環時(shi)間(jian)(jian)。PEG還可(ke)(ke)以防止納米(mi)顆粒(li)(li)在儲(chu)存(cun)過程以及血液中的(de)(de)(de)(de)聚集。此外，PEG脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)含(han)(han)(han)量(liang)(liang)(liang)可(ke)(ke)能(neng)決定(ding)顆粒(li)(li)的(de)(de)(de)(de)大小。PEG脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)另一(yi)個(ge)潛在用(yong)(yong)途是功能(neng)化LNP的(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)面，使(shi)(shi)LNPs與(yu)(yu)配體(ti)(ti)或生(sheng)物大分(fen)子結(jie)(jie)合(he)(he)(he)(he)成為可(ke)(ke)能(neng)。例如，Singh等(deng)(deng)使(shi)(shi)用(yong)(yong)DSPE-PEG-胺(an)通過NHS/EDC化學(xue)(xue)共軛(e)結(jie)(jie)合(he)(he)(he)(he)透明質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酸來靶向治(zhi)療(liao)腫瘤(liu)，Parhiz等(deng)(deng)使(shi)(shi)用(yong)(yong)DSPE-PEG-馬來酰亞(ya)胺(an)通過SATA-馬來酰亞(ya)胺(an)化學(xue)(xue)共軛(e)結(jie)(jie)合(he)(he)(he)(he)抗體(ti)(ti)。雖(sui)然(ran)PEG有助于(yu)(yu)LNP的(de)(de)(de)(de)穩定(ding)性和(he)(he)生(sheng)物偶聯，但其(qi)(qi)解(jie)吸(xi)對(dui)細(xi)(xi)(xi)胞轉染(ran)也(ye)至關重(zhong)要(yao)。PEG從(cong)LNPs中的(de)(de)(de)(de)脫(tuo)(tuo)落可(ke)(ke)使(shi)(shi)血清(qing)蛋白（如載脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)蛋白和(he)(he)白蛋白）產生(sheng)調(diao)理作用(yong)(yong)，這是LNPs發(fa)生(sheng)受(shou)體(ti)(ti)介(jie)(jie)導(dao)內吞作用(yong)(yong)的(de)(de)(de)(de)關鍵效應(ying)物。Akinc等(deng)(deng)人證明ApoE與(yu)(yu)LNPs結(jie)(jie)合(he)(he)(he)(he)后，導(dao)致低密(mi)度(du)(du)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)蛋白受(shou)體(ti)(ti)（LDLR）介(jie)(jie)導(dao)的(de)(de)(de)(de)肝細(xi)(xi)(xi)胞內化。由于(yu)(yu)PEG脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)抑(yi)制ApoE與(yu)(yu)LNPs的(de)(de)(de)(de)結(jie)(jie)合(he)(he)(he)(he)，過量(liang)(liang)(liang)的(de)(de)(de)(de)PEG 脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)會(hui)對(dui)LNPs的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞攝入(ru)和(he)(he)轉染(ran)產生(sheng)不(bu)利影(ying)響。含(han)(han)(han)有較少(shao)PEG脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)LNPs由于(yu)(yu)更容易與(yu)(yu)ApoE結(jie)(jie)合(he)(he)(he)(he)表(biao)(biao)現出更高的(de)(de)(de)(de)酸遞送效率。PEG脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)類脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)錨(mao)的(de)(de)(de)(de)長(chang)度(du)(du)也(ye)是決定(ding)解(jie)吸(xi)速(su)(su)率的(de)(de)(de)(de)重(zhong)要(yao)因(yin)素(su)。Mui等(deng)(deng)報道了PEG從(cong)LNP的(de)(de)(de)(de)脫(tuo)(tuo)落與(yu)(yu)PEG-脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)錨(mao)定(ding)長(chang)度(du)(du)成反比，這是因(yin)為PEG-脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)與(yu)(yu)LNP膜之(zhi)間(jian)(jian)的(de)(de)(de)(de)疏水相互作用(yong)(yong)隨著(zhu)PEG-脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)錨(mao)定(ding)長(chang)度(du)(du)的(de)(de)(de)(de)增(zeng)加(jia)而增(zeng)加(jia)。Suzuki等(deng)(deng)提出，PEG脫(tuo)(tuo)落的(de)(de)(de)(de)速(su)(su)度(du)(du)也(ye)可(ke)(ke)能(neng)影(ying)響抗-PEG抗體(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)產生(sheng)，并反復給藥(yao)會(hui)引起并發(fa)癥。靜脈給藥(yao)LNP配方中PEG脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)含(han)(han)(han)量(liang)(liang)(liang)很少(shao)超過2%；然(ran)而，密(mi)集的(de)(de)(de)(de)聚乙二醇層(ceng)可(ke)(ke)能(neng)有利于(yu)(yu)達到肝外靶點。Lee等(deng)(deng)的(de)(de)(de)(de)研(yan)究(jiu)結(jie)(jie)果顯示，相較2.5%的(de)(de)(de)(de)PEG脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)含(han)(han)(han)量(liang)(liang)(liang)，5%的(de)(de)(de)(de)PEG脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)含(han)(han)(han)量(liang)(liang)(liang)時(shi)LNPs在腫瘤(liu)中的(de)(de)(de)(de)積(ji)累更量(liang)(liang)(liang)高于(yu)(yu)，Lokugamage等(deng)(deng)的(de)(de)(de)(de)研(yan)究(jiu)表(biao)(biao)明，PEG脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)對(dui)霧(wu)化LNPs的(de)(de)(de)(de)遞送至關重(zhong)要(yao)。因(yin)此，LNPs中PEG脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)含(han)(han)(han)量(liang)(liang)(liang)和(he)(he)種(zhong)類可(ke)(ke)能(neng)需要(yao)根據臨(lin)床需求謹慎(shen)調(diao)整。

4.性(xing)質

LNPs的(de)(de)(de)平均尺(chi)(chi)寸(cun)(cun)和(he)尺(chi)(chi)寸(cun)(cun)分布是(shi)各(ge)種應用(yong)中(zhong)LNP質量(liang)和(he)適用(yong)性(xing)的(de)(de)(de)重(zhong)要(yao)初(chu)始決定(ding)因素，這(zhe)些(xie)性(xing)質通常用(yong)動(dong)態(tai)光散射(she)(she)（DLS）來(lai)(lai)研究。一般來(lai)(lai)說(shuo)，LNP的(de)(de)(de)最佳尺(chi)(chi)寸(cun)(cun)為20 - 200nm，因為這(zhe)個尺(chi)(chi)寸(cun)(cun)使其在(zai)流體（如血(xue)液和(he)淋巴）中(zhong)足夠(gou)穩定(ding)，同(tong)時(shi)(shi)(shi)能(neng)夠(gou)穿過間隙(xi)。LNP的(de)(de)(de)尺(chi)(chi)寸(cun)(cun)通常通過改變PEG脂質的(de)(de)(de)量(liang)或(huo)混(hun)合(he)參(can)數（如流速和(he)體積比(bi)）來(lai)(lai)調節(jie)。LNPs的(de)(de)(de)尺(chi)(chi)寸(cun)(cun)可(ke)能(neng)會影響其內吞、生物(wu)(wu)分布、降解和(he)清除，不同(tong)的(de)(de)(de)應用(yong)可(ke)能(neng)需要(yao)不同(tong)的(de)(de)(de)粒徑(jing)(jing)。例如，45 nm的(de)(de)(de)siRNA LNPs在(zai)皮下給藥(yao)(yao)時(shi)(shi)(shi)最有效(xiao)，而(er)80 nm 的(de)(de)(de)siRNA LNPs在(zai)小鼠(shu)靜脈(mo)給藥(yao)(yao)時(shi)(shi)(shi)最有效(xiao)。然而(er)，對(dui)嚙齒動(dong)物(wu)(wu)和(he)非人靈長(chang)類(lei)(lei)動(dong)物(wu)(wu)中(zhong)各(ge)種粒徑(jing)(jing)mRNA-LNP的(de)(de)(de)對(dui)比(bi)表明，非人靈長(chang)類(lei)(lei)動(dong)物(wu)(wu)肌肉(rou)注射(she)(she)時(shi)(shi)(shi)對(dui)LNPs粒徑(jing)(jing)不太敏(min)感。

LNP依靠(kao)表(biao)面(mian)電(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)與(yu)細胞膜(mo)和(he)生(sheng)物環(huan)境(jing)(jing)進行相(xiang)互作用(yong)(yong)。由于(yu)細胞膜(mo)帶(dai)(dai)負(fu)電(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)，表(biao)面(mian)帶(dai)(dai)負(fu)電(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)的(de)(de)(de)LNPs會(hui)(hui)被細胞膜(mo)排斥從(cong)而不被細胞吸收。另(ling)一方(fang)面(mian)，帶(dai)(dai)正(zheng)電(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)LNPs可(ke)能會(hui)(hui)直接破壞細胞膜(mo)，引起(qi)細胞毒性(xing)。這就凸顯了可(ke)電(dian)(dian)(dian)(dian)離脂(zhi)質(zhi)在(zai)LNP設計(ji)中(zhong)的(de)(de)(de)重要(yao)性(xing)：最初，含有可(ke)電(dian)(dian)(dian)(dian)離脂(zhi)質(zhi)的(de)(de)(de)LNP是(shi)中(zhong)性(xing)的(de)(de)(de)，可(ke)以(yi)(yi)避免任何不必要(yao)的(de)(de)(de)靜電(dian)(dian)(dian)(dian)相(xiang)互作用(yong)(yong)，但(dan)在(zai)酸(suan)性(xing)內體pH環(huan)境(jing)(jing)下會(hui)(hui)帶(dai)(dai)正(zheng)電(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)。LNPs的(de)(de)(de)表(biao)面(mian)電(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)通常用(yong)(yong)zeta電(dian)(dian)(dian)(dian)位測量來評(ping)估(gu)，該技(ji)術通常用(yong)(yong)于(yu)評(ping)估(gu)膠(jiao)體聚集，盡管沒有嚴格的(de)(de)(de)分類，但(dan)如果zeta電(dian)(dian)(dian)(dian)位落(luo)在(zai)-20和(he)+20 mV之間(jian)，則認為表(biao)面(mian)電(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)較弱。調(diao)整LNPs總表(biao)面(mian)電(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)的(de)(de)(de)一種常見方(fang)法(fa)是(shi)調(diao)整N/P比或者(zhe)說(shuo)電(dian)(dian)(dian)(dian)離脂(zhi)質(zhi)（N代表(biao)陽離子胺）與(yu)核酸(suan)（P代表(biao)陰離子磷酸(suan)鹽）的(de)(de)(de)比值。Carrasco等認為，增加(jia)(jia)含有可(ke)電(dian)(dian)(dian)(dian)離脂(zhi)質(zhi)KC2的(de)(de)(de)LNPs中(zhong)的(de)(de)(de)N/P比可(ke)以(yi)(yi)增加(jia)(jia)表(biao)面(mian)電(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)和(he)封裝效率。有趣的(de)(de)(de)是(shi)，在(zai)LNPs中(zhong)加(jia)(jia)入(ru)永久帶(dai)(dai)電(dian)(dian)(dian)(dian)的(de)(de)(de)脂(zhi)質(zhi)時可(ke)能在(zai)不增加(jia)(jia)表(biao)面(mian)電(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)的(de)(de)(de)情況下改變優(you)先攝取(qu)的(de)(de)(de)器官。Cheng等基于(yu)脂(zhi)質(zhi)電(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)在(zai)小鼠中(zhong)實(shi)現了選擇性(xing)器官靶向(xiang)（SORT）：向(xiang)LNP配方(fang)中(zhong)添加(jia)(jia)帶(dai)(dai)正(zheng)電(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)的(de)(de)(de)脂(zhi)質(zhi)可(ke)實(shi)現肺(fei)組織的(de)(de)(de)優(you)先轉染(ran)(ran)，而帶(dai)(dai)負(fu)電(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)的(de)(de)(de)脂(zhi)質(zhi)則將(jiang)轉染(ran)(ran)導向(xiang)脾臟。

脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)封(feng)包(bao)可(ke)能(neng)(neng)會影響從膜(mo)(mo)(mo)的(de)(de)(de)(de)水(shui)化和(he)(he)變形(xing)能(neng)(neng)力(li)到細胞攝取和(he)(he)核(he)(he)(he)酸釋放等(deng)許多參數。最(zui)(zui)近的(de)(de)(de)(de)一篇綜述總(zong)結了(le)形(xing)成(cheng)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)囊泡所需(xu)的(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)體的(de)(de)(de)(de)基(ji)礎知識。簡單地說(shuo)，每(mei)種(zhong)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)都可(ke)以用(yong)一個封(feng)包(bao)參數來描述，該參數取決(jue)于脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)極性“頭”和(he)(he)非極性“尾”所占的(de)(de)(de)(de)體積。結構(gou)平(ping)衡(heng)的(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)形(xing)成(cheng)柱(zhu)狀(zhuang)結構(gou)和(he)(he)層狀(zhuang)相(xiang)，而(er)“不平(ping)衡(heng)”結構(gou)則形(xing)成(cheng)六方(fang)、立(li)方(fang)和(he)(he)膠束相(xiang)。倒置(zhi)的(de)(de)(de)(de)六方(fang)相(xiang)（HII）表(biao)現出最(zui)(zui)顯著的(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)膜(mo)(mo)(mo)融合(he)促進(jin)作(zuo)用(yong)。到目(mu)前為(wei)(wei)止(zhi)，非層狀(zhuang)相(xiang)的(de)(de)(de)(de)可(ke)控制備(bei)在(zai)RNA-LNP遞送領(ling)域仍然(ran)是(shi)相(xiang)對少見(jian)的(de)(de)(de)(de)，納米(mi)立(li)方(fang)液(ye)晶是(shi)最(zui)(zui)突出的(de)(de)(de)(de)例子。然(ran)而(er)，LNPs在(zai)暴露于環境誘(you)因時(shi)可(ke)能(neng)(neng)發生結構(gou)變化。Heyes等(deng)利(li)用(yong)核(he)(he)(he)磁共振(zhen)波(bo)(bo)譜（P NMR）研究(jiu)了(le)含有一系列(lie)具有不同脂(zhi)(zhi)(zhi)尾的(de)(de)(de)(de)陽離(li)子脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)顆粒的(de)(de)(de)(de)相(xiang)變行為(wei)(wei)，發現層狀(zhuang)到倒置(zhi)六方(fang)相(xiang)轉變溫度（TBH）較(jiao)低的(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)具有更(geng)好的(de)(de)(de)(de)融合(he)促進(jin)能(neng)(neng)力(li)，這一點在(zai)基(ji)因沉默效率上得(de)到了(le)證明(ming)。同樣，其中(zhong)一個膜(mo)(mo)(mo)不穩(wen)(wen)定理論(lun)提出，當(dang)可(ke)電離(li)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)暴露于晚期(qi)核(he)(he)(he)內體的(de)(de)(de)(de)酸性pH時(shi)，可(ke)電離(li)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)與核(he)(he)(he)內體膜(mo)(mo)(mo)內磷脂(zhi)(zhi)(zhi)之間的(de)(de)(de)(de)靜電相(xiang)互作(zuo)用(yong)會導致膜(mo)(mo)(mo)破裂。Liu等(deng)最(zui)(zui)近的(de)(de)(de)(de)一項(xiang)工作(zuo)基(ji)于這一概念，報(bao)道了(le)利(li)用(yong)核(he)(he)(he)磁共振(zhen)波(bo)(bo)譜得(de)到的(de)(de)(de)(de)一種(zhong)新型(xing)可(ke)電離(li)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)暴露于核(he)(he)(he)內體模擬(ni)物時(shi)倒置(zhi)六方(fang)相(xiang)形(xing)成(cheng)的(de)(de)(de)(de)證據(ju)。雖然(ran)pH誘(you)導關(guan)聯是(shi)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)材料最(zui)(zui)常(chang)見(jian)的(de)(de)(de)(de)機制，但在(zai)我們最(zui)(zui)近的(de)(de)(de)(de)綜述中(zhong)討論(lun)了(le)其他導致核(he)(he)(he)內體膜(mo)(mo)(mo)不穩(wen)(wen)定的(de)(de)(de)(de)路徑(jing)。

由于脂(zhi)(zhi)(zhi)質相和整(zheng)體極(ji)性的(de)(de)(de)(de)(de)不同(tong)，脂(zhi)(zhi)(zhi)膜(mo)(mo)可能(neng)(neng)會捕獲水(shui)從而(er)改變(bian)膜(mo)(mo)的(de)(de)(de)(de)(de)流動(dong)(dong)(dong)性或變(bian)形性，這可能(neng)(neng)會影(ying)響(xiang)脂(zhi)(zhi)(zhi)膜(mo)(mo)融合(he)(he)。膜(mo)(mo)水(shui)合(he)(he)作用(yong)也(ye)可能(neng)(neng)影(ying)響(xiang)對(dui)pH的(de)(de)(de)(de)(de)潛在(zai)響(xiang)應，而(er)pH通常作為(wei)啟動(dong)(dong)(dong)核(he)酸釋放的(de)(de)(de)(de)(de)一個重(zhong)要環境(jing)誘(you)因(yin)。LNP在(zai)其生(sheng)命周期(qi)中(zhong)(zhong)所涉及的(de)(de)(de)(de)(de)pH波動(dong)(dong)(dong)如(ru)圖(tu)4所示(shi)。當LNPs進入(ru)細胞內空(kong)間時(shi)，它們被束縛(fu)在(zai)核(he)內體中(zhong)(zhong)，而(er)核(he)內體在(zai)成熟為(wei)溶酶體時(shi)會逐漸(jian)酸化(hua)。因(yin)此，脂(zhi)(zhi)(zhi)質膜(mo)(mo)內較高(gao)(gao)的(de)(de)(de)(de)(de)含(han)水(shui)量(liang)可能(neng)(neng)會影(ying)響(xiang)酸化(hua)動(dong)(dong)(dong)力學(xue)，并(bing)有加速膜(mo)(mo)的(de)(de)(de)(de)(de)失(shi)穩(wen)。Koitabashi等通過Laurdan實驗研(yan)(yan)究了(le)siRNA-LNPs中(zhong)(zhong)pH值對(dui)脂(zhi)(zhi)(zhi)膜(mo)(mo)穩(wen)定性的(de)(de)(de)(de)(de)影(ying)響(xiang)，發(fa)現膜(mo)(mo)水(shui)合(he)(he)作用(yong)與(yu)基因(yin)沉默效率呈正相關(guan)；然而(er)，該研(yan)(yan)究并(bing)未關(guan)注(zhu)酸化(hua)動(dong)(dong)(dong)力學(xue)。關(guan)于膜(mo)(mo)水(shui)合(he)(he)有一個有意思的(de)(de)(de)(de)(de)現象(xiang)，核(he)磁共振波譜結果(guo)表明(ming)，siRNA-LNPs比相同(tong)配(pei)方的(de)(de)(de)(de)(de)mRNA-LNPs的(de)(de)(de)(de)(de)含(han)水(shui)量(liang)更(geng)少，這可能(neng)(neng)是因(yin)為(wei)親(qin)水(shui)RNA鏈的(de)(de)(de)(de)(de)長度更(geng)長。Carrasco等進一步(bu)證明(ming)了(le)這些觀點，他們發(fa)現低N/P比的(de)(de)(de)(de)(de)KC2 LNPs單個納米顆粒中(zhong)(zhong)包(bao)含(han)更(geng)多的(de)(de)(de)(de)(de)mRNA和脂(zhi)(zhi)(zhi)質，并(bing)且有較高(gao)(gao)的(de)(de)(de)(de)(de)介電常數，認為(wei)低N/P比的(de)(de)(de)(de)(de)LNPs比高(gao)(gao)N/P比的(de)(de)(de)(de)(de)LNPs更(geng)易(yi)水(shui)合(he)(he)。更(geng)高(gao)(gao)的(de)(de)(de)(de)(de)RNA載量(liang)也(ye)會使轉染得到改善。因(yin)此，mRNA-LNPs可能(neng)(neng)對(dui)環境(jing)變(bian)化(hua)更(geng)敏感(gan)，盡管pH敏感(gan)性的(de)(de)(de)(de)(de)變(bian)化(hua)可能(neng)(neng)與(yu)生(sheng)物(wu)過程(cheng)的(de)(de)(de)(de)(de)時(shi)間尺度無關(guan)。暴露在(zai)生(sheng)物(wu)環境(jing)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)重(zhong)組進一步(bu)使LNP殼水(shui)化(hua)的(de)(de)(de)(de)(de)問(wen)題變(bian)得復雜。

圖4 LNP生(sheng)命(ming)周期(qi)中涉及的pH變化

LNPs固有(you)的(de)(de)(de)(de)水(shui)(shui)環境(jing)也對(dui)其(qi)長(chang)(chang)期(qi)穩(wen)(wen)定構成威脅(xie)。純核酸在(zai)(zai)環境(jing)條件(jian)下(xia)可(ke)(ke)(ke)(ke)通(tong)過外(wai)源RNase降解(jie)(jie)或自(zi)水(shui)(shui)解(jie)(jie)迅速惡化(hua)(hua)。雖然LNPs可(ke)(ke)(ke)(ke)以(yi)保(bao)護(hu)(hu)核酸免受酶降解(jie)(jie)，但(dan)它們容易因為熱(re)力學因素(su)（如最(zui)小化(hua)(hua)相分離）聚集，可(ke)(ke)(ke)(ke)能導致(zhi)納米顆(ke)粒融合(he)時(shi)核酸的(de)(de)(de)(de)丟失(shi)，最(zui)終影響轉染效率。低(di)溫(wen)保(bao)存和凍(dong)干可(ke)(ke)(ke)(ke)以(yi)保(bao)護(hu)(hu)RNA，但(dan)是(shi)冰結晶會(hui)損傷LNPs，盡(jin)管加入(ru)蔗(zhe)糖等低(di)溫(wen)保(bao)護(hu)(hu)劑似乎可(ke)(ke)(ke)(ke)以(yi)緩解(jie)(jie)這(zhe)(zhe)(zhe)個(ge)問題(ti)。有(you)趣的(de)(de)(de)(de)是(shi)，LNPs可(ke)(ke)(ke)(ke)能會(hui)根據(ju)儲(chu)存條件(jian)改變(bian)優(you)先攝取其(qi)的(de)(de)(de)(de)器官(guan)，這(zhe)(zhe)(zhe)可(ke)(ke)(ke)(ke)能是(shi)它們重組(zu)的(de)(de)(de)(de)結果。從實踐的(de)(de)(de)(de)角(jiao)度(du)來看(kan)，最(zui)近開發(fa)的(de)(de)(de)(de)針(zhen)對(dui)COVID-19的(de)(de)(de)(de)mRNA-LNP疫苗(miao)為RNA療法創建了(le)物流(liu)基(ji)礎設(she)施(shi)，這(zhe)(zhe)(zhe)可(ke)(ke)(ke)(ke)能會(hui)消(xiao)除關(guan)于LNP穩(wen)(wen)定性(xing)、存儲(chu)和運(yun)輸的(de)(de)(de)(de)許(xu)多擔憂。這(zhe)(zhe)(zhe)些(xie)疫苗(miao)擁有(you)在(zai)(zai)冷凍(dong)溫(wen)度(du)（-20°C）下(xia)長(chang)(chang)達(da)(da)6個(ge)月的(de)(de)(de)(de)以(yi)及(ji)室溫(wen)下(xia)長(chang)(chang)達(da)(da)30天的(de)(de)(de)(de)長(chang)(chang)期(qi)穩(wen)(wen)定性(xing)，極大地(di)推(tui)動了(le)這(zhe)(zhe)(zhe)些(xie)突破(po)性(xing)治(zhi)療的(de)(de)(de)(de)普及(ji)。值得注意(yi)的(de)(de)(de)(de)是(shi)，輝(hui)瑞(rui)/BioNTech和Moderna疫苗(miao)有(you)著不同(tong)的(de)(de)(de)(de)存儲(chu)要求，這(zhe)(zhe)(zhe)表明LNP配(pei)方(fang)的(de)(de)(de)(de)變(bian)化(hua)(hua)可(ke)(ke)(ke)(ke)能會(hui)顯著改變(bian)其(qi)核酸親(qin)和力和LNP穩(wen)(wen)定性(xing)。由(you)于目前(qian)還沒有(you)建立針(zhen)對(dui)這(zhe)(zhe)(zhe)些(xie)非晶材(cai)料的(de)(de)(de)(de)加速穩(wen)(wen)定性(xing)測(ce)試的(de)(de)(de)(de)方(fang)法，這(zhe)(zhe)(zhe)意(yi)味(wei)著，LNP穩(wen)(wen)定性(xing)只能在(zai)(zai)離散時(shi)間點進行經驗評(ping)估(gu)，差示掃(sao)描量熱(re)法（DSC）等方(fang)法可(ke)(ke)(ke)(ke)能對(dui)LNP退化(hua)(hua)提供有(you)價值的(de)(de)(de)(de)參(can)考。最(zui)后，預(yu)測(ce)基(ji)于LNP的(de)(de)(de)(de)RNA療法的(de)(de)(de)(de)下(xia)游(you)特性(xing)需(xu)要我(wo)們對(dui)LNP的(de)(de)(de)(de)自(zi)組(zu)裝過程有(you)更深的(de)(de)(de)(de)理解(jie)(jie)。

圖5 LNP結構待解決問題(ti)

5.結論(lun)和(he)展望

LNPs是一種(zhong)高度可(ke)定制的(de)(de)核酸載體，在(zai)mRNA疫苗中顯示出巨(ju)大(da)的(de)(de)潛力。我們(men)也不應忽視它們(men)在(zai)治(zhi)療罕見疾病(bing)和(he)癌(ai)癥方(fang)面的(de)(de)可(ke)能價值。mRNA治(zhi)療可(ke)以幫助產(chan)生(sheng)治(zhi)療性蛋白來(lai)恢(hui)復受損(sun)組織或器官的(de)(de)功(gong)能。全球開展了大(da)量(liang)的(de)(de)科學研(yan)究來(lai)設計和(he)細化(hua)LNPs的(de)(de)單個成(cheng)分，以便(bian)高效(xiao)和(he)安全地遞送(song)所(suo)關(guan)注的(de)(de)核酸。然(ran)而，LNP科學方(fang)興(xing)(xing)未艾，還有(you)許(xu)多懸而未決的(de)(de)問題，圖5中列出了其中的(de)(de)一些。毫無疑(yi)問，公眾對mRNA疫苗的(de)(de)持續高漲(zhang)的(de)(de)興(xing)(xing)趣(qu)將激勵這一領域的(de)(de)研(yan)究工作，我們(men)謹慎(shen)樂觀(guan)地認為，我們(men)正在(zai)見證納米醫(yi)學的(de)(de)新時代。

原(yuan)文來源：Chemistry of Lipid Nanoparticles for RNA Delivery.Acc Chem Res. 2022 Jan 4;55(1):2-12.