核酸脂質體納米粒LNP介紹及其制備方法

1. 什么是核酸脂質體納米粒LNP

脂質(zhi)(zhi)體（Liposome）最早(zao)在(zai)1961年(nian)由科(ke)學家Alec Douglas. Bangham 和 R. W. Horne在(zai)顯微鏡下(xia)發現。脂質(zhi)(zhi)體是(shi)(shi)由脂質(zhi)(zhi)分子(zi)(zi)組成(cheng)的囊泡結構，其(qi)脂質(zhi)(zhi)雙(shuang)分子(zi)(zi)層形(xing)成(cheng)疏水外殼(ke)和內部(bu)的水相空腔，兼具親水和疏水特性。脂質(zhi)(zhi)納(na)米(mi)(mi)粒(li)（Lipid Nanoparticle，LNP）是(shi)(shi)使(shi)用(yong)脂質(zhi)(zhi)形(xing)成(cheng)納(na)米(mi)(mi)微粒(li)的一種。在(zai)過去(qu)，科(ke)研(yan)人(ren)員通(tong)常使(shi)用(yong)脂質(zhi)(zhi)納(na)米(mi)(mi)粒(li)直接(jie)包裹化學藥物，在(zai)基因治(zhi)療領域，研(yan)究人(ren)員開始(shi)使(shi)用(yong)脂質(zhi)(zhi)納(na)米(mi)(mi)粒(li)包裹核酸，如mRNA、siRNA、pDNA等，稱為核酸脂質(zhi)(zhi)納(na)米(mi)(mi)粒(li)。

針對(dui)Covid-19新型(xing)冠狀病(bing)毒的mRNA疫(yi)苗開(kai)發，從病(bing)毒序列到成功上(shang)市只用了短短一年(nian)不到的時間。這(zhe)在(zai)從前是(shi)無法想象和(he)實現的。在(zai)這(zhe)次(ci)針對(dui)Covid-19新型(xing)冠狀病(bing)毒的mRNA疫(yi)苗上(shang)，莫德納(Moderna)采用了自(zi)主開(kai)發的可電離脂質SM-102，而輝瑞和(he)BioNTech則從Acuitas公司獲得了一種名為ALC-0315的可電離脂質的許可。

mRNA分子由于疫(yi)苗(miao)的(de)(de)(de)關(guan)系(xi)為大眾所(suo)認(ren)識，但是(shi)很(hen)多人(ren)(ren)卻不知道mRNA疫(yi)苗(miao)的(de)(de)(de)幕后功臣，甚至可(ke)以(yi)說是(shi)整(zheng)個(ge)(ge)機(ji)理的(de)(de)(de)關(guan)鍵(jian)所(suo)在(zai)，是(shi)將mRNA封裝并且安(an)全有(you)效(xiao)地送(song)進(jin)機(ji)體細胞的(de)(de)(de)脂質納(na)米粒(li)（Lipid Nanoparticle，LNP）。從技術(shu)上(shang)來講(jiang)，核酸(suan)藥(yao)物的(de)(de)(de)研發(fa)主要有(you)三個(ge)(ge)壁壘：第一個(ge)(ge)是(shi)原料端，包括mRNA原料序列的(de)(de)(de)篩選和修飾；第二個(ge)(ge)是(shi)遞送(song)系(xi)統；第三個(ge)(ge)是(shi)整(zheng)個(ge)(ge)藥(yao)物的(de)(de)(de)生產(chan)工藝。目前采(cai)用微(wei)流控技術(shu)產(chan)生脂質納(na)米顆粒(li)（LNP）， 將mRNA包裹在(zai)LNP 納(na)米顆粒(li)中(zhong)(zhong)，再(zai)進(jin)入人(ren)(ren)體, 是(shi)FDA唯一批準上(shang)市的(de)(de)(de)mRNA傳遞技術(shu)，并且已經在(zai)世界(jie)各(ge)地注(zhu)射(she)上(shang)億劑的(de)(de)(de)mRNA新冠疫(yi)苗(miao)中(zhong)(zhong)采(cai)用，其技術(shu)的(de)(de)(de)安(an)全性和有(you)效(xiao)性已經在(zai)這次全球的(de)(de)(de)新冠疫(yi)情中(zhong)(zhong)得到驗證。

 

2. 核酸脂質體納米(mi)粒LNP的作用機(ji)理

在(zai)包裹核酸的(de)(de)脂(zhi)質(zhi)(zhi)納米(mi)粒配方中(zhong)，起關(guan)鍵作(zuo)用的(de)(de)是可電離(li)脂(zhi)質(zhi)(zhi)。例如Onpattro中(zhong)的(de)(de)Dlin-MC3-DMA（簡稱(cheng)MC3），其pKa值在(zai)6.3-6.5 之間，這個特性(xing)讓它在(zai)血清的(de)(de)環(huan)境中(zhong)表面電荷(he)(he)基(ji)本(ben)為中(zhong)性(xing)，有利于(yu)細胞(bao)(bao)(bao)將(jiang)帶(dai)有核酸片段的(de)(de)脂(zhi)質(zhi)(zhi)納米(mi)粒整個吞進(jin)細胞(bao)(bao)(bao)內(nei)，形(xing)成(cheng)胞(bao)(bao)(bao)內(nei)體（endosome）。 一(yi)旦(dan)進(jin)入細胞(bao)(bao)(bao)后，胞(bao)(bao)(bao)內(nei)體的(de)(de)酸性(xing)環(huan)境使電離(li)脂(zhi)質(zhi)(zhi)的(de)(de)頭(tou)部質(zhi)(zhi)子化并帶(dai)正(zheng)電荷(he)(he)，從而(er)與胞(bao)(bao)(bao)內(nei)體的(de)(de)內(nei)膜融合，釋放(fang)目(mu)標核酸到(dao)細胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)發(fa)揮作(zuo)用。

 

圖1 核酸脂(zhi)質體納(na)米粒LNP的(de)作用機理

 

3. 核酸(suan)脂質體納米粒(li)LNP制備方法(fa)

最適合(he)(he)(he)的(de)(de)(de)技(ji)術(shu)還是(shi)采(cai)用(yong)微(wei)流控(kong)混(hun)合(he)(he)(he)技(ji)術(shu)來(lai)制(zhi)(zhi)(zhi)備(bei)核酸脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)納(na)(na)米(mi)(mi)粒(li)，該方法相(xiang)(xiang)對簡便快速(su)(su)(su)(su)，條(tiao)(tiao)件溫和(he)，同(tong)時容(rong)易實現生產放大。微(wei)流控(kong)技(ji)術(shu)基本原理(li)：將脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)與核酸分別溶(rong)解(jie)在(zai)水(shui)(shui)相(xiang)(xiang)和(he)有機相(xiang)(xiang)后，將兩(liang)(liang)相(xiang)(xiang)溶(rong)液(ye)注入制(zhi)(zhi)(zhi)備(bei)系(xi)統的(de)(de)(de)兩(liang)(liang)條(tiao)(tiao)入口通(tong)道，一端是(shi)RNA的(de)(de)(de)水(shui)(shui)溶(rong)液(ye)，一端是(shi)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)乙(yi)(yi)醇溶(rong)液(ye)，通(tong)過兩(liang)(liang)相(xiang)(xiang)的(de)(de)(de)快速(su)(su)(su)(su)混(hun)合(he)(he)(he)，完成核酸脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)納(na)(na)米(mi)(mi)顆粒(li)的(de)(de)(de)合(he)(he)(he)成。 改變流體注入速(su)(su)(su)(su)度和(he)比(bi)率，可(ke)以(yi)控(kong)制(zhi)(zhi)(zhi)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)納(na)(na)米(mi)(mi)顆粒(li)的(de)(de)(de)粒(li)徑大小。將各種脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)溶(rong)解(jie)在(zai)乙(yi)(yi)醇中(zhong)(zhong)，mRNA溶(rong)于酸性水(shui)(shui)緩(huan)沖(chong)液(ye)中(zhong)(zhong)，將兩(liang)(liang)相(xiang)(xiang)快速(su)(su)(su)(su)混(hun)合(he)(he)(he)。通(tong)過稀(xi)釋乙(yi)(yi)醇相(xiang)(xiang)，脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)溶(rong)解(jie)度降(jiang)低，在(zai)混(hun)合(he)(he)(he)溶(rong)液(ye)中(zhong)(zhong)逐漸(jian)析出(chu)凝固并形(xing)成脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)納(na)(na)米(mi)(mi)粒(li)，同(tong)時高效包載mRNA。再經緩(huan)沖(chong)液(ye)膜(mo)包超濾或(huo)者透(tou)析除(chu)去(qu)殘留的(de)(de)(de)乙(yi)(yi)醇，中(zhong)(zhong)和(he)緩(huan)沖(chong)液(ye)的(de)(de)(de)pH值。

 

4. 制備核酸脂質體納米粒LNP的(de)微流控芯(xin)片結構

利(li)用(yong)微流控芯(xin)片技(ji)術制備核酸脂(zhi)質(zhi)體(ti)納米粒(li)LNP主要(yao)(yao)是實現(xian)充分的混(hun)合，常采用(yong)魚骨(gu)結(jie)構(gou)。芯(xin)片中(zhong)魚骨(gu)結(jie)構(gou)區域(yu)使流經(jing)的液體(ti)產生(sheng)混(hun)沌流動，大(da)大(da)提(ti)高(gao)了液體(ti)的混(hun)合效(xiao)率，比傳統(tong)的攪拌混(hun)合均一性好(hao)，從(cong)而在芯(xin)片的出口處快速產生(sheng)均勻的流體(ti)。其中(zhong)的魚骨(gu)結(jie)構(gou)可以是凸起（如圖2所示），也可以是凹陷（如圖3所示），制備效(xiao)果跟(gen)(gen)體(ti)系有關，其粒(li)徑(jing)大(da)小主要(yao)(yao)跟(gen)(gen)流速比有關。

 

圖2 魚骨結構(gou)凸(tu)起

圖3 魚骨結構(gou)凹(ao)陷

 

目(mu)前高校研究所及(ji)部(bu)分公司客戶(hu)尚處在核酸(suan)脂(zhi)質(zhi)體納米粒(li)LNP的(de)配方開發(fa)階段，常選(xuan)用(yong)帶魚骨結構(gou)的(de)PDMS芯(xin)片(pian)進行研究，一(yi)方面是因(yin)為PDMS材質(zhi)的(de)芯(xin)片(pian)加(jia)工周期短，成(cheng)本低，另一(yi)方面是因(yin)為PDMS芯(xin)片(pian)的(de)特性使得實驗參數更易獲得。以下3款(kuan)核酸(suan)脂(zhi)質(zhi)體納米粒(li)LNP制備微流控(kong)芯(xin)片(pian)是研究者經常使用(yong)的(de)。

 

圖4 ZX-LS-11核酸脂(zhi)質體納米粒LNP制備芯片(pian)（魚骨結(jie)構凸起）

圖5 ZX-LS-31核酸脂質體納米粒LNP制備芯片（魚骨結構凹陷）

圖(tu)6 ZX-LS-31P核酸脂質體納(na)米粒LNP制備芯片（魚骨結構(gou)凹陷(xian)）

圖(tu)7 魚骨結構核(he)酸脂(zhi)質體納米(mi)粒LNP制(zhi)備芯片(pian)實物圖(tu)（PDMS微流控芯片(pian)）

 

5. 制備(bei)核酸脂(zhi)質體(ti)納米(mi)粒(li)LNP的進樣設(she)備(bei)

中(zhong)(zhong)芯啟(qi)(qi)(qi)恒(heng)恒(heng)壓(ya)泵(beng)（壓(ya)力(li)驅(qu)動微流(liu)(liu)(liu)體進(jin)樣儀(yi)）用于(yu)生成(cheng)穩定無脈沖的(de)(de)液(ye)流(liu)(liu)(liu)，其響應(ying)時間短，適(shi)用于(yu)各(ge)種要求苛刻的(de)(de)微流(liu)(liu)(liu)體應(ying)用。壓(ya)力(li)控制(zhi)器(qi)由計算(suan)機通過 USB 接口控制(zhi)，使用中(zhong)(zhong)芯啟(qi)(qi)(qi)恒(heng) FluidicLab Suite 軟件(jian)，可以生成(cheng)復雜(za)的(de)(de)壓(ya)力(li)或(huo)流(liu)(liu)(liu)速曲線 ( 如正弦(xian)波(bo)，方波(bo)，三角波(bo)等 )。配套的(de)(de)中(zhong)(zhong)芯啟(qi)(qi)(qi)恒(heng)FluidicLab Suite 軟件(jian)可記錄(lu)并輸出壓(ya)力(li)控制(zhi)器(qi)產(chan)生的(de)(de)數(shu)據(ju)。

 

圖8 中芯啟恒恒壓泵連接示意圖

 

將壓力控(kong)制器(qi) 1 通(tong)道與 4 mm PU 管(guan)(guan)一端連(lian)(lian)接(jie)，然后(hou)把連(lian)(lian)接(jie)儲液(ye)(ye)(ye)池的(de) PTFE 管(guan)(guan)與流量(liang)傳(chuan)感(gan)器(qi)的(de)“in”接(jie)口(kou)相(xiang)連(lian)(lian)，流量(liang)傳(chuan)感(gan)器(qi)的(de)另一端“out”連(lian)(lian)接(jie) PTFE 管(guan)(guan)作為液(ye)(ye)(ye)體輸出(chu)口(kou)，最終(zhong)組裝出(chu)設備如圖1所示。其余3個通(tong)道的(de)連(lian)(lian)接(jie)與之相(xiang)同(tong)。進樣(yang)原理(li)是：以氣推液(ye)(ye)(ye)，氣體管(guan)(guan)在儲液(ye)(ye)(ye)池頁(ye)面以上，出(chu)液(ye)(ye)(ye)管(guan)(guan)在儲液(ye)(ye)(ye)池液(ye)(ye)(ye)面以下，氣體擠(ji)(ji)壓液(ye)(ye)(ye)面，將液(ye)(ye)(ye)體從出(chu)液(ye)(ye)(ye)管(guan)(guan)擠(ji)(ji)出(chu)，實現(xian)進樣(yang)操作。

 

5.1 恒壓泵（壓力驅動微流體進樣(yang)儀）特點：

壓力輸出波動小于 0.02% ，響應時間 9 ms，無論恒流輸出還是變流 速輸出，均可應對自如。
卓越的性能：
1）內置壓力傳感器，高速 PID 控制，壓力輸出波動：< 0.02%
2） 響應時間：< 9 ms
3）可安裝四個獨立的壓力輸出通道 多種壓力輸出范圍（0-0.2 bar，0-2 bar, 0-8 bar, -1-1 bar, -1-6 bar)，并可根據客 戶要求定制
4）可設置恒流輸出（需接流量傳感器）和壓力波形輸出

 

5.2 壓(ya)力控制器(qi)軟件的使用：

圖9中芯啟(qi)恒恒壓泵壓力控(kong)制窗口(kou)

 

如圖(tu)9所示，可以直(zhi)接設置(zhi)各通道的壓(ya)力參(can)數(shu)，每(mei)個通道的壓(ya)力參(can)數(shu)可以設置(zhi)不同(tong)。

 

圖(tu)10中芯啟(qi)恒恒壓泵壓力控制設置窗口

 

如(ru)圖10所示，用戶可以設(she)置(zhi)實(shi)時壓(ya)力(li)的讀(du)取(qu)間(jian)隔(ge)，其最低設(she)定(ding)值為 0.001s ( 實(shi)測讀(du)取(qu)時最短讀(du)取(qu)周期約為 0.02 s，低于此間(jian)隔(ge)的數據是重復的 )。備注信息，壓(ya)力(li)校準和(he)同步增(zeng)減系數設(she)置(zhi)（多路壓(ya)力(li)協同輸(shu)出(chu)）也可以在此操作。

 

6. 制備(bei)的(de)核酸脂質體納米粒LNP的(de)粒徑范圍(wei)

如(ru)圖11所示，利用帶魚骨結構的(de)(de)微流控芯片制(zhi)備的(de)(de)核酸脂(zhi)質體(ti)納米粒(li)LNP平均粒(li)徑在142nm左右。

圖11 制備的核(he)酸(suan)脂質體(ti)納米粒LNP的粒徑范(fan)圍