Life Med|脂質納米顆粒靶向遞送mRNA研(yan)發策略

湃客：Life Medicine 2022-06-28 07:06

針對近幾年席卷全球的新型冠狀病毒（COVID-19），疫苗研發一直是布局重點和焦點，被寄予厚望。其中，BNT162b（商品名Comirnaty）和mRNA-1273（商品名Spikevax）兩款mRNA納米疫苗以其極高的保護效率和研發速度聞名于世，并迅速引發國內外廣泛關注。目前，以mRNA疫苗為研究熱點的核酸疫苗被視為是繼（減毒）滅活疫苗、亞單位疫苗之后的第三代新型疫苗，正在引領疫苗研發的潮流，相關產業也正如火如荼的進行中。“新冠”mRNA疫苗的成功同時推動了全球范圍內mRNA的產業化進程。 這些事件的背后實際上是mRNA分子優化、體內遞送等底層相關技術取得的長足進展，特別是在脂質納米顆粒（LNPs）遞送平臺的突破。一般認為，LNPs是遞送mRNA最好的選擇之一，若要擴寬mRNA的應用場景，研發靶向遞送LNPs技術至關重要。

底層技術的發展加速mRNA應用

自20世紀60年代mRNA被發現以來(lai)，有關mRNA的(de)應用(yong)探索就一刻也不曾停止。mRNA分(fen)子具有不穩定性、免疫原性、無法高(gao)效進(jin)入細胞等特點，在實際應用(yong)中非(fei)常受限。隨(sui)著mRNA分(fen)子優(you)化(hua)技術(shu)、遞送(song)技術(shu)平臺的(de)不斷發展，這些缺點正在慢(man)慢(man)地被克服。

其(qi)一，mRNA分子優(you)化平臺，包括有(you)(you)：1）序列優(you)化的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)進(jin)展，如(ru)5，3端非翻(fan)譯區序列的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)篩選、多聚(ju)腺嘌呤（poly A）尾巴的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)長度優(you)化、開放閱讀框（ORF）密碼子的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)優(you)選等；2）核苷酸化學修飾的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)引入，如(ru)5-甲基(ji)尿苷和(he)(he)(he)N1-甲基(ji)假尿苷的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)使(shi)用不僅能(neng)(neng)降低mRNA的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)免疫原性，還(huan)能(neng)(neng)提高其(qi)穩(wen)定性；3）制(zhi)備工(gong)藝的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)提升(sheng)，如(ru)體外(wai)轉(zhuan)(zhuan)錄（IVT）放大工(gong)藝的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)成(cheng)(cheng)熟、加(jia)帽工(gong)序的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)簡化、純化和(he)(he)(he)質(zhi)檢方法的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)穩(wen)定等。其(qi)二，遞送載(zai)體平臺，尤其(qi)是LNPs遞送技術的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)相對(dui)成(cheng)(cheng)熟。一般來講，LNPs由四種成(cheng)(cheng)分組成(cheng)(cheng)，每種成(cheng)(cheng)分都扮演著相對(dui)重(zhong)(zhong)要的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)角(jiao)色：可電離陽離子脂(zhi)質(zhi)被(bei)認為是LNPs中(zhong)最重(zhong)(zhong)要的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)成(cheng)(cheng)分，它(ta)直接決定了mRNA的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)包裹效(xiao)率(lv)和(he)(he)(he)遞送效(xiao)率(lv)；中(zhong)性輔助(zhu)磷脂(zhi)（如(ru)DSPC、DOPE）和(he)(he)(he)膽固醇脂(zhi)質(zhi)有(you)(you)助(zhu)于提升(sheng)LNPs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)穩(wen)定性以及轉(zhuan)(zhuan)染效(xiao)率(lv)；聚(ju)乙(yi)二醇脂(zhi)（PEG-Lipid）在調節LNPs尺寸、穩(wen)定性、半衰期(qi)、遞送效(xiao)率(lv)等方面的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)作(zuo)用也十分明顯。值得指出的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)是，LNPs中(zhong)單一成(cheng)(cheng)分并非獨自行使(shi)功能(neng)(neng)，各(ge)組分之間的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)配比在mRNA的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)實際應用中(zhong)非常重(zhong)(zhong)要。

通過多(duo)手段研(yan)(yan)發技術(shu)，目前LNPs-mRNA已被(bei)應用(yong)到多(duo)個領域，包括疫苗研(yan)(yan)發、針對(dui)多(duo)種重大疾(ji)病的(de)蛋(dan)白(bai)替代療(liao)法(fa)(fa)、基因編輯(ji)療(liao)法(fa)(fa)、細胞療(liao)法(fa)(fa)等方面。 

LNPs靶(ba)向遞送策略擴寬mRNA應用場景(jing)

mRNA精準遞送是(shi)保證治療效果的(de)(de)必要條件之一。針對體(ti)表的(de)(de)組(zu)織(zhi)器(qi)官(guan)（如肌肉、眼(yan)等(deng)）可(ke)通過局部給藥方式實(shi)(shi)現(xian)，而體(ti)內更深(shen)層(ceng)次器(qi)官(guan)的(de)(de)遞送則選擇(ze)靜脈注射更為合(he)適(shi)。靜脈給藥后LNPs介導(dao)的(de)(de)肝臟靶(ba)向較容(rong)易實(shi)(shi)現(xian)，如何實(shi)(shi)現(xian)肝外的(de)(de)選擇(ze)性遞送則具有挑(tiao)戰。針對此(ci)科學問(wen)題，研究人員嘗試了(le)多種策略(lve)，取得了(le)不(bu)錯進展。本亮點(dian)文(wen)章重(zhong)點(dian)總(zong)結了(le)近期發表的(de)(de)幾類mRNA靶(ba)向遞送策略(lve)。

（一）靶向(xiang)分子修飾

在(zai)(zai)LNPs表面進(jin)行靶(ba)向(xiang)(xiang)分子(zi)修(xiu)(xiu)飾(shi)是實(shi)現(xian)細(xi)胞(bao)靶(ba)向(xiang)(xiang)遞送(song)(song)最直接的(de)方法。Jonathan A. Epstein教授(shou)團隊最近利(li)用CD5抗(kang)(kang)體修(xiu)(xiu)飾(shi)包裹了CAR mRNA的(de)LNPs，可(ke)提高其體內靶(ba)向(xiang)(xiang)T淋(lin)巴細(xi)胞(bao)的(de)能力(li)。將上述mRNA制劑靜脈(mo)注(zhu)射到(dao)心(xin)衰小鼠模型(xing)后，可(ke)在(zai)(zai)體內對(dui)(dui)T細(xi)胞(bao)進(jin)行重(zhong)編(bian)程，使(shi)其形成有功能的(de)CAR-T細(xi)胞(bao)，可(ke)以(yi)(yi)靶(ba)向(xiang)(xiang)過度(du)活躍的(de)心(xin)臟(zang)(zang)成纖(xian)維細(xi)胞(bao)，有效降低了心(xin)臟(zang)(zang)纖(xian)維化，并幫助小鼠恢復了心(xin)臟(zang)(zang)功能。Dan Peer教授(shou)團隊通過重(zhong)組融合蛋白（MadCAM-1-D1D2-Fc）修(xiu)(xiu)飾(shi)LNPs技術，將mRNA選(xuan)擇性遞送(song)(song)到(dao)特(te)定白細(xi)胞(bao)亞群，在(zai)(zai)結腸炎小鼠模型(xing)中展現(xian)出了潛在(zai)(zai)的(de)治療前景(jing)。不(bu)同于(yu)抗(kang)(kang)體修(xiu)(xiu)飾(shi)，Gabriel A. Kwong課(ke)題組最近開發了一種(zhong)光控的(de)多肽(tai)配(pei)體置換(huan)平臺，可(ke)快速變換(huan)修(xiu)(xiu)飾(shi)到(dao)LNPs表面的(de)靶(ba)向(xiang)(xiang)抗(kang)(kang)原多肽(tai)，在(zai)(zai)體內實(shi)現(xian)對(dui)(dui)多種(zhong)抗(kang)(kang)原特(te)異(yi)性T細(xi)胞(bao)群的(de)靶(ba)向(xiang)(xiang)mRNA遞送(song)(song)。以(yi)(yi)上修(xiu)(xiu)飾(shi)技術可(ke)顯著增(zeng)強(qiang)對(dui)(dui)特(te)定細(xi)胞(bao)類型(xing)的(de)靶(ba)向(xiang)(xiang)遞送(song)(song)能力(li)，但在(zai)(zai)特(te)異(yi)性方面略顯不(bu)足。

（二）高通量篩選

上文提(ti)到，可(ke)(ke)離(li)子化陽離(li)子脂質(zhi)是LNPs中(zhong)最(zui)重要的(de)(de)(de)(de)(de)成分。通(tong)(tong)過結構各異(yi)的(de)(de)(de)(de)(de)化學(xue)結構庫進行高(gao)(gao)通(tong)(tong)量篩(shai)(shai)(shai)選(xuan)(xuan)(xuan)早(zao)已被證(zheng)實是研(yan)發靶(ba)向LNPs最(zui)為有效的(de)(de)(de)(de)(de)方(fang)法之(zhi)一(yi)，目(mu)前大多數LNPs是由此(ci)技(ji)術(shu)研(yan)發產生的(de)(de)(de)(de)(de)，可(ke)(ke)實現肝、肺、脾、腦等器官的(de)(de)(de)(de)(de)mRNA遞送(song),但此(ci)方(fang)法相對盲目(mu)、工作(zuo)量大。James Dahlman課題(ti)組結合(he)“DNA條形碼”和深(shen)度測序(xu)技(ji)術(shu)，開發了一(yi)種新型的(de)(de)(de)(de)(de)高(gao)(gao)通(tong)(tong)量篩(shai)(shai)(shai)選(xuan)(xuan)(xuan)技(ji)術(shu)，簡稱為FIND，可(ke)(ke)顯著提(ti)升LNPs的(de)(de)(de)(de)(de)篩(shai)(shai)(shai)選(xuan)(xuan)(xuan)效率。他(ta)(ta)們(men)將(jiang)Cre mRNA和特定序(xu)列的(de)(de)(de)(de)(de)DNA條形碼包裹(guo)到同(tong)一(yi)個LNPs中(zhong)，只需設計不同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)DNA條形碼就(jiu)可(ke)(ke)制備出帶有特定“標簽”的(de)(de)(de)(de)(de)一(yi)系列LNPs-mRNA藥物(wu)。將(jiang)這些“標簽”各異(yi)的(de)(de)(de)(de)(de)LNPs通(tong)(tong)過靜脈一(yi)起注(zhu)射到Cre誘(you)導表達tdTom的(de)(de)(de)(de)(de)轉基因小鼠中(zhong)，利用流式細(xi)胞儀檢測tdTom陽性細(xi)胞，并結合(he)DNA深(shen)度測序(xu)的(de)(de)(de)(de)(de)方(fang)法可(ke)(ke)鑒別出特定細(xi)胞靶(ba)向的(de)(de)(de)(de)(de)LNPs載體。通(tong)(tong)過該體系，他(ta)(ta)們(men)可(ke)(ke)同(tong)步(bu)篩(shai)(shai)(shai)選(xuan)(xuan)(xuan)超200種LNPs，顯著提(ti)高(gao)(gao)了LNPs的(de)(de)(de)(de)(de)篩(shai)(shai)(shai)選(xuan)(xuan)(xuan)效率。

（三）可預測性LNPs優化(hua)

區別于高通量篩選，如果給出明確的LNPs設計原則，則會大大縮短研發周期，提高研發效率。Daniel Siegwart課題組2020年在Nature Nanotechnology上報道了一種可預測性設計的LNPs研發技術，命名為SORT。在原有4組分LNPs基礎上，僅添加一種帶有不同電荷的新脂質分子（SORT分子），則可實現mRNA在小鼠的肝臟、脾臟、肺部的靶向遞送和基因編輯。通過增加陽離子脂質能夠使mRNA特異遞送進入肺部；陰離子脂質能夠使mRNA特異進入脾臟；而可離子化陽離子脂質則會增強肝臟的靶向遞送。重要的是，SORT技術具有普適性，可在多種類型的LNPs基礎上快速研發出肝外器官靶向LNPs。進一步機制探究發現，SORT分子可調控SORT-LNPs在器官水平的生物分布、LNPs自身pka、及表面血清蛋白冠等，這些因素最終決定了LNPs在體內的靶向遞送能力。文中指出，在器官靶向遞送方面，LNPs表面的血清蛋白冠起到最關鍵作用，識別這些獨特的蛋白質可能會在未來研發靶向其他器官的LNPs方面有所幫助。

圖1. 體(ti)內靶向(xiang)遞(di)送mRNA-LNPs的研發策略(lve)。

總結與展望
器(qi)官選擇性(xing)遞送對(dui)于(yu)拓寬mRNA臨(lin)床應用至關重(zhong)要(yao)。本文提到的(de)(de)幾種(zhong)代表性(xing)策(ce)略在(zai)一定程度上提出了解(jie)決方案，但各(ge)有(you)不(bu)足之(zhi)處。如(ru)何開發出靶(ba)向(xiang)其(qi)他(ta)重(zhong)要(yao)器(qi)官（如(ru)心臟(zang)(zang)、胰腺、腎臟(zang)(zang)）的(de)(de)LNPs、如(ru)何實現對(dui)特定臟(zang)(zang)器(qi)中(zhong)特定細胞類(lei)型的(de)(de)靶(ba)向(xiang)遞送都是未來需(xu)要(yao)解(jie)決的(de)(de)重(zhong)要(yao)問題(ti)。隨(sui)著研(yan)究人員(yuan)對(dui)mRNA靶(ba)向(xiang)遞送技術的(de)(de)深(shen)入(ru)研(yan)究，相信未來會(hui)有(you)更多的(de)(de)靶(ba)向(xiang)遞送策(ce)略研(yan)發出來用于(yu)精準醫療研(yan)究。

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原文鏈接：//doi.org/10.1093/lifemedi/lnac004