目前SARS-CoV-2臨(lin)床試(shi)驗用脂(zhi)質納米顆(ke)粒的(de)開(kai)發(fa)

mRNA最早的(de)(de)(de)轉染(ran)試劑是(shi)季(ji)銨(an)(an)化(hua)陽離(li)(li)(li)子(zi)DOTAP結(jie)合(he)(he)可(ke)電離(li)(li)(li)和(he)融合(he)(he)的(de)(de)(de)DOPE，采用(yong)(yong)DNA轉染(ran)[85]，用(yong)(yong)于在(zai)(zai)(zai)眾多(duo)細胞類型中(zhong)(zhong)(zhong)轉染(ran)mRNA[86]。盡管在(zai)(zai)(zai)體(ti)(ti)外有效，但(dan)永久(jiu)性(xing)(xing)(xing)陽離(li)(li)(li)子(zi)季(ji)銨(an)(an)基團使這些大尺寸的(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)復(fu)合(he)(he)物從循(xun)環和(he)其通常靶器官肺中(zhong)(zhong)(zhong)迅速清除，并表現(xian)出毒(du)性(xing)(xing)(xing)。今天LNP的(de)(de)(de)先驅(qu)是(shi)穩(wen)定的(de)(de)(de)質(zhi)(zhi)粒-脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)顆粒(SPLP)，它是(shi)由(you)融合(he)(he)基因電離(li)(li)(li)的(de)(de)(de)DOPE與季(ji)銨(an)(an)化(hua)的(de)(de)(de)陽離(li)(li)(li)子(zi)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)DODAC結(jie)合(he)(he)形(xing)成(cheng)的(de)(de)(de)，DODAC靜(jing)電結(jie)合(he)(he)并包裹質(zhi)(zhi)粒DNA，然(ran)后(hou)用(yong)(yong)親水性(xing)(xing)(xing)PEG包被，使其在(zai)(zai)(zai)水介質(zhi)(zhi)中(zhong)(zhong)(zhong)穩(wen)定，并在(zai)(zai)(zai)體(ti)(ti)內(nei)(nei)給藥(yao)時(shi)限制蛋白質(zhi)(zhi)和(he)細胞相互(hu)作(zuo)用(yong)(yong)[87]。DOPE在(zai)(zai)(zai)細胞攝取后(hou)可(ke)在(zai)(zai)(zai)內(nei)(nei)涵(han)體(ti)(ti)中(zhong)(zhong)(zhong)質(zhi)(zhi)子(zi)化(hua)，由(you)于呈(cheng)錐(zhui)形(xing)，因此可(ke)與內(nei)(nei)涵(han)體(ti)(ti)磷脂(zhi)(zhi)(zhi)形(xing)成(cheng)內(nei)(nei)體(ti)(ti)溶解離(li)(li)(li)子(zi)對(dui)，以(yi)促(cu)進(jin)內(nei)(nei)涵(han)體(ti)(ti)釋放(fang)，這是(shi)成(cheng)功遞送的(de)(de)(de)關鍵事件[17]。然(ran)后(hou)進(jin)一(yi)步將SPLP開發(fa)為含有siRNA的(de)(de)(de)穩(wen)定核酸脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)顆粒(SNALP)，包括四(si)種脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)：離(li)(li)(li)子(zi)化(hua)而不是(shi)季(ji)銨(an)(an)化(hua)陽離(li)(li)(li)子(zi)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)、飽(bao)和(he)雙層形(xing)成(cheng)季(ji)銨(an)(an)化(hua)兩性(xing)(xing)(xing)離(li)(li)(li)子(zi)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)、DSPC、膽固(gu)醇和(he)PEG脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)[88]。除了(le)與核酸靜(jing)電結(jie)合(he)(he)外，SNALPs中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)可(ke)電離(li)(li)(li)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)發(fa)揮了(le)融合(he)(he)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)作(zuo)用(yong)(yong)，并在(zai)(zai)(zai)內(nei)(nei)涵(han)體(ti)(ti)中(zhong)(zhong)(zhong)質(zhi)(zhi)子(zi)化(hua)，與內(nei)(nei)涵(han)體(ti)(ti)磷脂(zhi)(zhi)(zhi)形(xing)成(cheng)膜(mo)不穩(wen)定離(li)(li)(li)子(zi)對(dui)。目(mu)前已知DSPC有助于在(zai)(zai)(zai)PEG表面(mian)下形(xing)成(cheng)穩(wen)定的(de)(de)(de)雙層[89]。膽固(gu)醇發(fa)揮多(duo)種作(zuo)用(yong)(yong)，包括填補(bu)顆粒間隙(xi)、限制LNP–蛋白質(zhi)(zhi)相互(hu)作(zuo)用(yong)(yong)和(he)可(ke)能促(cu)進(jin)膜(mo)融合(he)(he)[90]。可(ke)電離(li)(li)(li)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)在(zai)(zai)(zai)生(sheng)理pH下呈(cheng)中(zhong)(zhong)(zhong)性(xing)(xing)(xing)，從而消除循(xun)環中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)任何陽離(li)(li)(li)子(zi)電荷，但(dan)在(zai)(zai)(zai)pH~6.5的(de)(de)(de)內(nei)(nei)體(ti)(ti)中(zhong)(zhong)(zhong)質(zhi)(zhi)子(zi)化(hua)，促(cu)進(jin)內(nei)(nei)體(ti)(ti)釋放(fang)，發(fa)揮核心作(zuo)用(yong)(yong)。

2018年(nian)臨床(chuang)批(pi)準(zhun)的(de)首個siRNA產(chan)品(pin)的(de)開(kai)發(fa)主(zhu)要集(ji)中(zhong)在優(you)化可(ke)電離脂質(zhi)，其次是(shi)(shi)PEG脂質(zhi)和LNP中(zhong)使用的(de)四種脂質(zhi)的(de)比(bi)例，以及LNP組裝和生產(chan)程(cheng)序。根據分子形狀假設[12,91]，發(fa)現C18尾(wei)中(zhong)不飽和鍵(jian)的(de)最佳數量(liang)(liang)是(shi)(shi)通過醚連(lian)(lian)接(jie)到二甲胺頭(tou)基(ji)的(de)二亞油(you)酸(suan)尾(wei)[88]。然而(er)，在亞油(you)酸(suan)尾(wei)部引入單個連(lian)(lian)接(jie)體(ti)，其具有從二甲胺頭(tou)基(ji)到連(lian)(lian)接(jie)體(ti)的(de)優(you)化碳(tan)數，導(dao)致LNP中(zhong)可(ke)電離脂質(zhi)DLin-MC3-DMA的(de)pKa接(jie)近(jin)6.4[92,93]。優(you)化的(de)最后一步是(shi)(shi)將MC3/DSPC/膽(dan)固醇/PEG–脂質(zhi)的(de)這些脂質(zhi)摩爾比(bi)調(diao)節至50/10/38.5/1.5。總體(ti)從DLin-DMA到DLin-MC3-DMA的(de)這一優(you)化過程(cheng)需要在數千(qian)種制劑中(zhong)篩(shai)選超過300種可(ke)電離的(de)脂質(zhi)，并導(dao)致效(xiao)價增加200倍和有效(xiao)劑量(liang)(liang)相應減少，以實現對(dui)靶基(ji)因(yin)> 80%的(de)持久抑(yi)制和允許(xu)治(zhi)療窗，2018年(nian)Onpattro™獲(huo)得臨床(chuang)批(pi)準(zhun)[94,95]。這種為siRNA開(kai)發(fa)的(de)MC3配方是(shi)(shi)隨后開(kai)發(fa)LNPs的(de)基(ji)礎，如下所述（圖1），在被批(pi)準(zhun)用于SARS-CoV-2 mRNA疫(yi)苗(miao)的(de)遞送后，LNPs現在正被緊急使用。

圖(tu)1 mRNA脂(zhi)質納米顆粒結構。最近使用冷凍(dong)電子(zi)顯(xian)微鏡[96]、小角(jiao)(jiao)中子散射和小角(jiao)(jiao)X射線散射[89]進行的研究表(biao)明，mRNA脂(zhi)質(zhi)納米顆粒包括低(di)拷貝數的mRNA(1-10)，并且mRNA與占據LNP中心核心的可電離脂質結合。聚乙二醇(PEG)脂(zhi)質形(xing)成脂(zhi)質納(na)米顆粒(LNP)的表面，同(tong)時形成雙層(ceng)的DSPC。帶電(dian)荷和不帶電(dian)荷的膽固醇和可電(dian)離脂(zhi)質(zhi)可分布在(zai)整個(ge)LNP中。其他(ta)輸送系(xi)統的結構示意圖在(zai)最(zui)近的綜述中提供[14]。

Moderna使(shi)用上(shang)述Onpattro制(zhi)劑(ji)中的(de)MC3進行了(le)幾項(xiang)臨(lin)床(chuang)前[97,98,99]和臨(lin)床(chuang)研究[97,100]，以遞送核苷修飾(shi)的(de)mRNA編碼免疫原。在這些(xie)比較新的(de)一類可電離脂質(zhi)與MC3的(de)研究中，MC3后來被(bei)確定為可電離脂質(zhi)[42,101]。這個新類別包括Lipid H[42]，它是Moderna的(de)SARS-CoV-2產(chan)品mRNA-1273中的(de)可電離脂質(zhi)SM-102[41]（表2）。

使用針對(dui)寨卡病毒的(de)(de)(de)(de)(de)核(he)苷修(xiu)飾(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)mRNA編(bian)碼免(mian)(mian)(mian)疫(yi)原，MC3 LNP能(neng)(neng)(neng)(neng)夠(gou)保(bao)護缺乏I型(xing)和II型(xing)干擾素(IFN)信號的(de)(de)(de)(de)(de)免(mian)(mian)(mian)疫(yi)功能(neng)(neng)(neng)(neng)低下(xia)小(xiao)鼠免(mian)(mian)(mian)受10µg劑(ji)(ji)量(liang)(liang)1次或(huo)2µg劑(ji)(ji)量(liang)(liang)初免(mian)(mian)(mian)-加強免(mian)(mian)(mian)疫(yi)設計的(de)(de)(de)(de)(de)致死攻擊[99]。在預先給予(yu)抗(kang)ifnar1阻斷抗(kang)體以建(jian)立(li)致死模(mo)型(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)免(mian)(mian)(mian)疫(yi)功能(neng)(neng)(neng)(neng)正常小(xiao)鼠中(zhong)(zhong)也(ye)獲得了(le)(le)相(xiang)似的(de)(de)(de)(de)(de)結果。在一系(xi)列遞送核(he)苷修(xiu)飾(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)mRNA編(bian)碼血(xue)凝素(HA)免(mian)(mian)(mian)疫(yi)原的(de)(de)(de)(de)(de)流(liu)感研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)中(zhong)(zhong)，皮內遞送的(de)(de)(de)(de)(de)MC3 LNP能(neng)(neng)(neng)(neng)夠(gou)完全保(bao)護小(xiao)鼠免(mian)(mian)(mian)受低至(zhi)0.4µg單次給藥的(de)(de)(de)(de)(de)致死性(xing)攻擊，盡(jin)管即使單次給予(yu)高達10µg劑(ji)(ji)量(liang)(liang)，攻毒后(hou)也(ye)會出現體重減輕[97]。雪貂單次給予(yu)50µg或(huo)100µg劑(ji)(ji)量(liang)(liang)產生(sheng)了(le)(le)較高的(de)(de)(de)(de)(de)HAI（血(xue)凝抑制試(shi)驗）滴度(du)(du)，非人靈長類動(dong)物單次給予(yu)200或(huo)400µg劑(ji)(ji)量(liang)(liang)也(ye)產生(sheng)了(le)(le)較高的(de)(de)(de)(de)(de)HAI滴度(du)(du)。在接受100µg劑(ji)(ji)量(liang)(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)少數(23)人類受試(shi)者中(zhong)(zhong)，在研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)開始(shi)時，所有(you)受試(shi)者的(de)(de)(de)(de)(de)HAI滴度(du)(du)均(jun) > 40（who保(bao)護相(xiang)關性(xing)），比基線高4倍以上。在一項(xiang)更大規模(mo)的(de)(de)(de)(de)(de)1期試(shi)驗中(zhong)(zhong)，使用相(xiang)同的(de)(de)(de)(de)(de)MC3 LNPs遞送兩(liang)種(zhong)不(bu)(bu)(bu)同的(de)(de)(de)(de)(de)核(he)苷修(xiu)飾(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)mRNA編(bian)碼的(de)(de)(de)(de)(de)HA免(mian)(mian)(mian)疫(yi)原，肌肉注射100µg的(de)(de)(de)(de)(de)H10N8免(mian)(mian)(mian)疫(yi)原導致23名受試(shi)者中(zhong)(zhong)100%的(de)(de)(de)(de)(de)HAI滴度(du)(du) > 40[100]。盡(jin)管未發生(sheng)危(wei)及生(sheng)命的(de)(de)(de)(de)(de)不(bu)(bu)(bu)良(liang)事(shi)件(jian)(jian)，但(dan)這23例受試(shi)者中(zhong)(zhong)有(you)3例發生(sheng)了(le)(le)重度(du)(du)3級不(bu)(bu)(bu)良(liang)事(shi)件(jian)(jian)。3例受試(shi)者中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)2例發生(sheng)3級不(bu)(bu)(bu)良(liang)事(shi)件(jian)(jian)（符(fu)合研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)暫停規則）后(hou)，停止計劃的(de)(de)(de)(de)(de)400µg給藥。在較低劑(ji)(ji)量(liang)(liang)下(xia)，不(bu)(bu)(bu)良(liang)事(shi)件(jian)(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)頻率(lv)和嚴(yan)重程度(du)(du)降低，但(dan)幾乎每例受試(shi)者均(jun)發生(sheng)至(zhi)少1起不(bu)(bu)(bu)良(liang)事(shi)件(jian)(jian)。這些研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)很有(you)前景，但(dan)也(ye)強調了(le)(le)在不(bu)(bu)(bu)會引起問題(ti)數量(liang)(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)不(bu)(bu)(bu)良(liang)事(shi)件(jian)(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)劑(ji)(ji)量(liang)(liang)下(xia)獲得保(bao)護性(xing)免(mian)(mian)(mian)疫(yi)的(de)(de)(de)(de)(de)治療(liao)窗(chuang)相(xiang)對(dui)較窄。這讓人想(xiang)起MC3前體DLin-DMA的(de)(de)(de)(de)(de)治療(liao)窗(chuang)窄，需(xu)要提高效力才(cai)能(neng)(neng)(neng)(neng)降低劑(ji)(ji)量(liang)(liang)，仍然(ran)實現有(you)效的(de)(de)(de)(de)(de)基因敲(qiao)低。

表2脂質納(na)米顆(ke)粒中使(shi)用(yong)(yong)的(de)可電(dian)離脂質。脂質納(na)米顆(ke)粒中使(shi)用(yong)(yong)的(de)可電(dian)離脂質的(de)一個關鍵特征是，通過(guo)TNS染料結合試驗測定，LNP中可電離脂質的pKa應在6-7范圍內。理論上計算(suan)的(de)大多(duo)數可電離基團的(de)pKa在8-9.5范(fan)圍(wei)內(nei)，如下所示在氮原子(zi)上，使用商(shang)業軟件理(li)論上估計水介質中的這些值。pKa從理論(lun)值下降2-3個點(dian)至TNS值是由于(yu)脂相(xiang)中(zhong)質子的(de)溶劑化能量更高，導致脂相(xiang)中(zhong)的(de)pH值比水相高2-3個(ge)點，在(zai)TNS測定期(qi)間測量pH值[102]。

由(you)于(yu)siRNA產(chan)品(pin)需要重(zhong)復給(gei)藥治療慢(man)性(xing)(xing)疾病，人們擔(dan)心(xin)MC3中(zhong)二亞油酸(suan)烷(wan)基(ji)尾的(de)(de)緩慢(man)降(jiang)解(jie)會導(dao)致重(zhong)復給(gei)藥的(de)(de)蓄積和(he)潛(qian)在(zai)毒性(xing)(xing)。MC3的(de)(de)生物可(ke)降(jiang)解(jie)版(ban)本脂(zhi)質(zhi)319（表(biao)2）是(shi)通過用在(zai)體(ti)(ti)內(nei)(nei)易(yi)于(yu)被(bei)酯酶降(jiang)解(jie)的(de)(de)伯酯取代(dai)每個烷(wan)基(ji)鏈(lian)中(zhong)兩(liang)個雙(shuang)鍵中(zhong)的(de)(de)一個而(er)產(chan)生的(de)(de)[68]。觀(guan)察(cha)到脂(zhi)質(zhi)319在(zai)肝臟中(zhong)的(de)(de)半(ban)衰期(qi)小于(yu)1小時，而(er)其在(zai)肝臟中(zhong)保(bao)持與(yu)MC3相似(si)的(de)(de)基(ji)因沉默(mo)效率。在(zai)體(ti)(ti)內(nei)(nei)證實了(le)(le)降(jiang)解(jie)產(chan)物，以及其分(fen)泌和(he)脂(zhi)質(zhi)319的(de)(de)無毒性(xing)(xing)質(zhi)。在(zai)SARS-CoV-2的(de)(de)臨床前和(he)臨床研究中(zhong)引用了(le)(le)脂(zhi)質(zhi)319的(de)(de)研究，作為BioNTech[49]和(he)CureVac[53,69]產(chan)品(pin)中(zhong)使用的(de)(de)Acuitas LNP類別(bie)，盡管在(zai)倫敦帝國理(li)工學(xue)院試(shi)驗[60]中(zhong)Acuitas LNP遞送(song)的(de)(de)自擴(kuo)增(zeng)RNA被(bei)引用為包含在(zai)最近(jin)的(de)(de)專利申請中(zhong)[59]，這里由(you)Acuitas的(de)(de)Lipid A9代(dai)表(biao)（表(biao)2）。最近(jin)，BioNTech批準的(de)(de)BNT162b2中(zhong)Acuitas可(ke)電離脂(zhi)質(zhi)的(de)(de)同一性(xing)(xing)被(bei)披露為ALC-0315[40]（表(biao)2）。這些LNPs的(de)(de)一個重(zhong)要方面是(shi)，它們是(shi)通過篩選IV給(gei)藥后肝臟中(zhong)的(de)(de)mRNA表(biao)達(da)而(er)開(kai)發(fa)的(de)(de)，可(ke)能還沒有(you)完(wan)全(quan)優(you)化用于(yu)基(ji)于(yu)mRNA的(de)(de)疫苗(miao)的(de)(de)肌內(nei)(nei)給(gei)藥。

Moderna最(zui)近開發了(le)一類新(xin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)可(ke)電離(li)脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)來替代MC3，主要是(shi)(shi)(shi)(shi)由(you)于上述與(yu)MC3降(jiang)解(jie)(jie)緩慢(man)相(xiang)關的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)問題，但也努力(li)通(tong)(tong)過實現比二(er)(er)(er)亞(ya)油酸MC3烷基(ji)尾(wei)更大(da)(da)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)支(zhi)(zhi)(zhi)來提(ti)高其效(xiao)(xiao)力(li)[42,101]。這類新(xin)脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)具有(you)乙醇胺(an)可(ke)電離(li)頭基(ji)，與(yu)含有(you)一級(ji)降(jiang)解(jie)(jie)酯（如Maier 2013）的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)單(dan)個(ge)飽(bao)和尾(wei)連接，并(bing)(bing)與(yu)第二(er)(er)(er)個(ge)飽(bao)和尾(wei)連接，后者使用(yong)降(jiang)解(jie)(jie)性(xing)較低的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)二(er)(er)(er)級(ji)酯在(zai)(zai)7個(ge)碳原(yuan)子后分(fen)支(zhi)(zhi)(zhi)成兩(liang)個(ge)飽(bao)和C8尾(wei)，如脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)5[101]（表(biao)2）。優化用(yong)于肝(gan)(gan)臟(zang)IV給(gei)(gei)藥(yao)(yao)，發現相(xiang)似(si)(si)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)H[42]或SM-102是(shi)(shi)(shi)(shi)疫苗肌(ji)內(nei)(IM)給(gei)(gei)藥(yao)(yao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)最(zui)佳(jia)選擇。分(fen)支(zhi)(zhi)(zhi)增(zeng)加(jia)(jia)是(shi)(shi)(shi)(shi)Acuitas追求的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)共(gong)同(tong)特征，因(yin)為(wei)Lipid A9共(gong)有(you)5個(ge)分(fen)支(zhi)(zhi)(zhi)鏈[59]（表(biao)2），而(er)Moderna LNPs有(you)3個(ge)分(fen)支(zhi)(zhi)(zhi)鏈。分(fen)支(zhi)(zhi)(zhi)增(zeng)加(jia)(jia)被(bei)認為(wei)可(ke)產生(sheng)具有(you)更多錐形結(jie)構的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)可(ke)電離(li)脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)，因(yin)此，當與(yu)內(nei)體(ti)(ti)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)陰離(li)子磷(lin)脂(zhi)配對時，將發生(sheng)更大(da)(da)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)膜(mo)破(po)壞能(neng)力(li)，遵循幾十年前概述的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)子形狀假設[12,91]。當IV給(gei)(gei)藥(yao)(yao)時，24h時在(zai)(zai)肝(gan)(gan)臟(zang)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)檢(jian)測不到(dao)脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)5，而(er)MC3以其初(chu)始劑量(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)71%存在(zai)(zai)于肝(gan)(gan)臟(zang)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)，驗(yan)(yan)證Lipid 5的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)降(jiang)解(jie)(jie)性(xing)。IV給(gei)(gei)藥(yao)(yao)后，Lipid 5在(zai)(zai)小(xiao)鼠中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)熒(ying)光素酶表(biao)達的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)效(xiao)(xiao)力(li)是(shi)(shi)(shi)(shi)MC3的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)3倍(bei)(bei)，在(zai)(zai)非人靈長(chang)類動物中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)hEPO的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)效(xiao)(xiao)力(li)是(shi)(shi)(shi)(shi)MC3的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)5倍(bei)(bei)。這些(xie)效(xiao)(xiao)力(li)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)增(zeng)加(jia)(jia)與(yu)胞內(nei)體(ti)(ti)釋(shi)放(fang)(fang)增(zeng)加(jia)(jia)一致，可(ke)能(neng)是(shi)(shi)(shi)(shi)由(you)胞內(nei)體(ti)(ti)釋(shi)放(fang)(fang)增(zeng)加(jia)(jia)引起(qi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)，對于Lipid 5，細(xi)胞中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)高達15%的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)mRNA從胞內(nei)體(ti)(ti)釋(shi)放(fang)(fang)，而(er)MC3為(wei)2.5%，后者與(yu)之前使用(yong)siRNA測定的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)MC3的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)結(jie)果(guo)相(xiang)似(si)(si)[106]。然而(er)，在(zai)(zai)這些(xie)內(nei)體(ti)(ti)釋(shi)放(fang)(fang)實驗(yan)(yan)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)，MC3的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)胞攝(she)取是(shi)(shi)(shi)(shi)Lipid 5的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)4倍(bei)(bei)，因(yin)此這兩(liang)種LNPs在(zai)(zai)細(xi)胞質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)釋(shi)放(fang)(fang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)mRNA的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)絕對量(liang)相(xiang)似(si)(si)。在(zai)(zai)疫苗的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)肌(ji)內(nei)給(gei)(gei)藥(yao)(yao)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)檢(jian)查了(le)相(xiang)同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)可(ke)電離(li)脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)庫，同(tong)樣發現可(ke)降(jiang)解(jie)(jie)，并(bing)(bing)且由(you)于伯酯而(er)迅速消除，并(bing)(bing)且對于流感核苷修飾的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)mRNA%__，與(yu)MC3相(xiang)比，在(zai)(zai)蛋白表(biao)達或免(mian)(mian)疫原(yuan)性(xing)方(fang)面效(xiao)(xiao)價通(tong)(tong)常增(zeng)加(jia)(jia)3-6倍(bei)(bei)。小(xiao)鼠中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)%編碼(ma)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)免(mian)(mian)疫原(yuan)，盡(jin)管(guan)非人靈長(chang)類動物中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)免(mian)(mian)疫原(yuan)性(xing)與(yu)5µg初(chu)免(mian)(mian)-加(jia)(jia)強免(mian)(mian)疫劑量(liang)下的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)MC3相(xiang)同(tong)[42]。脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)H或SM-102（表(biao)2）被(bei)確定為(wei)最(zui)佳(jia)候選藥(yao)(yao)物，在(zai)(zai)結(jie)構上僅(jin)與(yu)通(tong)(tong)過伯酯的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)二(er)(er)(er)碳置換確定為(wei)IV給(gei)(gei)藥(yao)(yao)最(zui)佳(jia)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)5不同(tong)。脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)5 LNP的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)pKa為(wei)6.56，而(er)脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)H LNP的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)pKa為(wei)6.68，表(biao)明IM與(yu)IV給(gei)(gei)藥(yao)(yao)相(xiang)比，pKa略微(wei)增(zeng)加(jia)(jia)可(ke)能(neng)有(you)益，盡(jin)管(guan)該差異在(zai)(zai)試驗(yan)(yan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)變(bian)異性(xing)范圍內(nei)。大(da)(da)鼠肌(ji)肉注(zhu)(zhu)射(she)部(bu)位的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)組織學檢(jian)查表(biao)明，與(yu)MC3相(xiang)比，Lipid HLNPs吸引的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)性(xing)粒(li)細(xi)胞和巨(ju)噬細(xi)胞富集的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)炎性(xing)浸(jin)潤較少，這可(ke)能(neng)會降(jiang)低人體(ti)(ti)試驗(yan)(yan)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)注(zhu)(zhu)射(she)部(bu)位的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)反應原(yuan)性(xing)[42]。

目前SARS-CoV-2臨(lin)床試驗中(zhong)的(de)mRNA脂質(zhi)納米顆粒

5.1.BioNTech/Pfizer

Acuitas ALC-0315（表2）結(jie)合DSPC、膽(dan)固(gu)醇和(he)PEG脂質是(shi)BioNTech SARS-COV-2試(shi)驗(yan)中的遞(di)送系統[40]。CureVac和(he)倫敦帝國理工學院(yuan)也可能使用ALC-0315，或可能使用A9（表2）。

BioNTech開始用4種(zhong)mRNA編(bian)碼(ma)的(de)(de)(de)(de)(de)免疫原開發其SARS-CoV-2疫苗，其中2種(zhong)是核苷修(xiu)(xiu)飾的(de)(de)(de)(de)(de)，1種(zhong)是未修(xiu)(xiu)飾的(de)(de)(de)(de)(de)，1種(zhong)是自我擴增(zeng)的(de)(de)(de)(de)(de)。有兩種(zhong)核苷修(xiu)(xiu)飾的(de)(de)(de)(de)(de)mRNA的(de)(de)(de)(de)(de)報(bao)道：BNT162b1是編(bian)碼(ma)刺(ci)突蛋白受(shou)體結(jie)合域(yu)的(de)(de)(de)(de)(de)短的(de)(de)(de)(de)(de)~1kb序列，通(tong)過foldon三聚體結(jie)構域(yu)修(xiu)(xiu)飾，通(tong)過多價顯示(shi)增(zeng)加免疫原性。較長的(de)(de)(de)(de)(de)4.3kb BNT162b2編(bian)碼(ma)一個(ge)二脯氨酸穩定(ding)的(de)(de)(de)(de)(de)全長膜結(jie)合刺(ci)突蛋白。BNT162b2最(zui)近獲(huo)得了歐(ou)盟和美國的(de)(de)(de)(de)(de)緊急批準。

在(zai)一項臨床前(qian)研究中(zhong)(zhong)(zhong)，小鼠單次(ci)給予0.2、1和(he)(he)5µg BNT162b2后，可檢測到結(jie)(jie)合抗(kang)體和(he)(he)中(zhong)(zhong)(zhong)和(he)(he)滴(di)度。從最(zui)(zui)低(di)劑(ji)量(liang)(liang)到最(zui)(zui)高劑(ji)量(liang)(liang)增加一個數量(liang)(liang)級，在(zai)Th2細胞(bao)(bao)(bao)因子水平非(fei)常低(di)的(de)(de)CD4 + 和(he)(he)CD8 + 脾(pi)細胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)(zhong)(zhong)引起強烈的(de)(de)抗(kang)原特異性Th1 IFNγ和(he)(he)IL-2應答[49]。引流淋巴結(jie)(jie)中(zhong)(zhong)(zhong)還含有大量(liang)(liang)生(sheng)發中(zhong)(zhong)(zhong)心B細胞(bao)(bao)(bao)以及CD4 + 和(he)(he)CD8 + 濾泡輔助性T(Tfh)細胞(bao)(bao)(bao)計(ji)數升高，這(zhe)些細胞(bao)(bao)(bao)先前(qian)被(bei)確定為mRNA LNP疫苗(miao)中(zhong)(zhong)(zhong)LNP單獨誘導(dao)的(de)(de)一部分(fen)[33]。在(zai)非(fei)人(ren)靈長類動物(wu)中(zhong)(zhong)(zhong)，30µg或100µg的(de)(de)初免-加強免疫劑(ji)量(liang)(liang)引起的(de)(de)結(jie)(jie)合抗(kang)體和(he)(he)中(zhong)(zhong)(zhong)和(he)(he)滴(di)度是(shi)人(ren)恢復期試(shi)驗組(zu)的(de)(de)10倍以上，并且產生(sheng)強烈的(de)(de)Th1偏倚T細胞(bao)(bao)(bao)應答，該應答被(bei)認為對預防疫苗(miao)相(xiang)關的(de)(de)增強呼吸道疾(ji)病很重要(yao)[107]。在(zai)有限數量(liang)(liang)(6)的(de)(de)攻毒(du)恒河猴中(zhong)(zhong)(zhong)，兩(liang)次(ci)100µg劑(ji)量(liang)(liang)在(zai)支氣管肺(fei)泡灌(guan)洗和(he)(he)鼻拭(shi)子中(zhong)(zhong)(zhong)檢測不(bu)到病毒(du)滴(di)度。

較小mRNA編碼免疫(yi)原(yuan)BNT162b1的(de)1期臨(lin)床試(shi)驗(yan)計劃在第(di)1天和(he)(he)第(di)21天給予(yu)10、30和(he)(he)100µg劑(ji)量(liang)(liang)(liang)(liang)。中等(deng)劑(ji)量(liang)(liang)(liang)(liang)30µg誘導的(de)抗體結(jie)合和(he)(he)中和(he)(he)滴(di)度(du)分別是(shi)人恢復期組的(de)30倍和(he)(he)3倍。由于首次(ci)給藥后存在重度(du)注(zhu)射部位疼(teng)痛(tong)，因此(ci)未給予(yu)100µg劑(ji)量(liang)(liang)(liang)(liang)進行加(jia)強(qiang)(qiang)劑(ji)量(liang)(liang)(liang)(liang)。30µg加(jia)強(qiang)(qiang)劑(ji)量(liang)(liang)(liang)(liang)組100%的(de)受試(shi)者(zhe)報告了(le)注(zhu)射部位疼(teng)痛(tong)，但(dan)嚴重程度(du)為(wei)輕(qing)度(du)或中度(du)。以30µg劑(ji)量(liang)(liang)(liang)(liang)第(di)二次(ci)接種疫(yi)苗后，幾乎(hu)所有(you)受試(shi)者(zhe)均發生輕(qing)度(du)或中度(du)全身(shen)不良事(shi)件發熱(re)、寒戰(zhan)或疲乏(fa)。該試(shi)驗(yan)還證明(ming)了(le)外周血單(dan)核細胞(bao)對Th1偏(pian)倚T細胞(bao)的(de)強(qiang)(qiang)烈應答[50]。

一(yi)項2期(qi)試(shi)驗在(zai)(zai)年(nian)輕（18-55歲）和年(nian)長（65-85歲）受(shou)(shou)試(shi)者(zhe)組中(zhong)比較了BNT162b1和BNT162b2[51]。老年(nian)受(shou)(shou)試(shi)者(zhe)的(de)結合和中(zhong)和抗體滴(di)度(du)略低(di)，但仍超過恢復(fu)期(qi)組。與年(nian)輕受(shou)(shou)試(shi)者(zhe)相比，老年(nian)受(shou)(shou)試(shi)者(zhe)的(de)不(bu)良反應(ying)嚴重程度(du)也(ye)降低(di)。與BNT162b1相比，在(zai)(zai)BNT162b2中(zhong)發(fa)現全身(shen)不(bu)良事(shi)件（發(fa)熱、寒戰、疲乏）的(de)頻(pin)率顯著降低(di)約兩倍。正是(shi)BNT162b2耐受(shou)(shou)性的(de)增加推(tui)動(dong)了其選擇進(jin)入3期(qi)試(shi)驗，最近宣布(bu)了94%的(de)有效(xiao)性，因為在(zai)(zai)安慰劑組中(zhong)發(fa)生了162例COVID-19病(bing)例，而在(zai)(zai)接受(shou)(shou)兩次30µg BNT162b2給藥的(de)疫苗(miao)接種組中(zhong)僅發(fa)現了8例病(bing)例[3]

5.2. Moderna

在(zai)(zai)(zai)(zai)Moderna的(de)(de)研(yan)究中(zhong)(zhong)，核苷修飾(shi)的(de)(de)mRNA編碼(ma)免疫原是一種(zhong)跨(kua)膜錨定的(de)(de)二(er)脯氨酸穩定的(de)(de)融(rong)合前刺突，具(ju)有天然的(de)(de)furin裂解(jie)位點，并(bing)在(zai)(zai)(zai)(zai)原型(xing)MC3 LNP基礎上的(de)(de)LNP中(zhong)(zhong)遞送(song)，只是用Lipid H(SM-102)替代MC3[41,42]。該mRNA LNP(mRNA-1273)在(zai)(zai)(zai)(zai)第1天和(he)(he)第21天以(yi)1µg劑(ji)(ji)(ji)量注射時在(zai)(zai)(zai)(zai)幾種(zhong)小鼠(shu)種(zhong)屬中(zhong)(zhong)誘導中(zhong)(zhong)和(he)(he)抗體(ti)，但在(zai)(zai)(zai)(zai)0.1µg劑(ji)(ji)(ji)量時未(wei)誘導中(zhong)(zhong)和(he)(he)抗體(ti)[44]。T細胞應(ying)答(da)似乎是平衡的(de)(de)Th1/Th2應(ying)答(da)，在(zai)(zai)(zai)(zai)小鼠(shu)適應(ying)的(de)(de)病(bing)毒(du)(du)攻(gong)毒(du)(du)模型(xing)中(zhong)(zhong)，小鼠(shu)肺(fei)和(he)(he)鼻(bi)甲中(zhong)(zhong)的(de)(de)病(bing)毒(du)(du)滴度(du)在(zai)(zai)(zai)(zai)2次劑(ji)(ji)(ji)量1µg給(gei)藥后(hou)降(jiang)低至(zhi)基線，但在(zai)(zai)(zai)(zai)0.1µg給(gei)藥后(hou)未(wei)降(jiang)低。在(zai)(zai)(zai)(zai)恒河猴(hou)中(zhong)(zhong)，2劑(ji)(ji)(ji)100µg劑(ji)(ji)(ji)量在(zai)(zai)(zai)(zai)外周血中(zhong)(zhong)產生高結合和(he)(he)中(zhong)(zhong)和(he)(he)滴度(du)以(yi)及(ji)Th1偏倚反應(ying)，也涉及(ji)強烈的(de)(de)Tfh反應(ying)[45]。兩個(ge)10µg劑(ji)(ji)(ji)量組的(de)(de)滴度(du)和(he)(he)T細胞應(ying)答(da)顯著(zhu)降(jiang)低。同樣，100µg劑(ji)(ji)(ji)量能夠將支氣管肺(fei)泡灌(guan)洗液(ye)和(he)(he)鼻(bi)拭子中(zhong)(zhong)的(de)(de)病(bing)毒(du)(du)滴度(du)降(jiang)低至(zhi)基線，而10µg僅在(zai)(zai)(zai)(zai)肺(fei)部降(jiang)低。

在(zai)(zai)1期(qi)(qi)研究(jiu)中(zhong)(zhong)，每組(zu)15例(li)(li)患者(zhe)接受(shou)2劑(ji)25、100或250µg，間隔(ge)4周，結合和(he)中(zhong)(zhong)和(he)滴度比100µg劑(ji)量(liang)(liang)(liang)的(de)(de)(de)恢復期(qi)(qi)高約10倍，約相(xiang)(xiang)當(dang)于25µg的(de)(de)(de)恢復期(qi)(qi)[46]。100µg和(he)250µg劑(ji)量(liang)(liang)(liang)組(zu)所有受(shou)試(shi)者(zhe)均報(bao)告征(zheng)集性不良(liang)事件(jian)，250µg組(zu)14例(li)(li)受(shou)試(shi)者(zhe)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)3例(li)(li)報(bao)告重度不良(liang)事件(jian)并停藥。在(zai)(zai)隨后的(de)(de)(de)老年(nian)患者(zhe)（56-71歲和(he)71歲以上）1期(qi)(qi)研究(jiu)中(zhong)(zhong)，發(fa)現(xian)25µg和(he)100µg劑(ji)量(liang)(liang)(liang)產生(sheng)的(de)(de)(de)結合抗體滴度高于恢復期(qi)(qi)血(xue)漿，而100µg劑(ji)量(liang)(liang)(liang)的(de)(de)(de)中(zhong)(zhong)和(he)滴度相(xiang)(xiang)當(dang)，但低于25µg劑(ji)量(liang)(liang)(liang)的(de)(de)(de)恢復期(qi)(qi)[43]。大多數(shu)患者(zhe)（約80%）在(zai)(zai)第(di)二次接種疫苗后仍發(fa)生(sheng)不良(liang)事件(jian)，即使(shi)是在(zai)(zai)老年(nian)組(zu)。外(wai)周血(xue)分析顯示CD4 T細胞應答存(cun)在(zai)(zai)Th1偏倚(yi)。與(yu)25µg劑(ji)量(liang)(liang)(liang)相(xiang)(xiang)比，100µg劑(ji)量(liang)(liang)(liang)的(de)(de)(de)中(zhong)(zhong)和(he)滴度更(geng)高，因此選擇該劑(ji)量(liang)(liang)(liang)用于3期(qi)(qi)試(shi)驗(yan)，中(zhong)(zhong)期(qi)(qi)結果顯示90例(li)(li)COVID-19病例(li)(li)在(zai)(zai)安慰劑(ji)組(zu)與(yu)5例(li)(li)在(zai)(zai)疫苗接種組(zu)具有94.5%的(de)(de)(de)有效性[2]。一個(ge)獨立的(de)(de)(de)委員會對Moderna的(de)(de)(de)3期(qi)(qi)試(shi)驗(yan)進行(xing)了中(zhong)(zhong)期(qi)(qi)分析，發(fa)現(xian)嚴重不良(liang)事件(jian)包括9.7%的(de)(de)(de)參與(yu)者(zhe)出(chu)現(xian)疲勞(lao)，8.9%出(chu)現(xian)肌肉疼痛(tong)，5.2%出(chu)現(xian)關節痛(tong)，4.5%出(chu)現(xian)頭(tou)痛(tong)，而在(zai)(zai)輝瑞(rui)/BioNTech的(de)(de)(de)3期(qi)(qi)試(shi)驗(yan)中(zhong)(zhong)，頻率較低的(de)(de)(de)是疲勞(lao)為(wei)3.8%，頭(tou)痛(tong)為(wei)2%[108]。

5.3. CureVac

The CureVac mRNA LNP(CVnCoV)是一種非(fei)(fei)化學修飾的(de)序列工程mRNA，編碼在Acuitas LNP中遞(di)送的(de)二(er)(er)脯氨酸(suan)穩定的(de)全(quan)長(chang)S蛋白，可(ke)能使用可(ke)電離(li)脂質ALC-0315。在小鼠(shu)中使用2µg劑(ji)量(liang)時，檢查了兩次給(gei)藥(yao)(yao)之(zhi)間的(de)周數，范(fan)圍(wei)為1-4周，發現Balb/c小鼠(shu)中較長(chang)的(de)間隔產(chan)生了較高的(de)滴度和T細胞應(ying)答以(yi)及(ji)平衡的(de)Th1/Th2應(ying)答[53]。需要第二(er)(er)次給(gei)藥(yao)(yao)以(yi)產(chan)生中和抗體(ti)，0.25µg的(de)兩次給(gei)藥(yao)(yao)不(bu)足(zu)以(yi)產(chan)生中和抗體(ti)。在敘利亞(ya)金黃地鼠(shu)中，兩次10µg劑(ji)量(liang)（而(er)非(fei)(fei)2µg）能夠將肺（而(er)非(fei)(fei)鼻(bi)甲）中的(de)病毒滴度降低(di)至基(ji)線。

在(zai)檢查2-12µg劑量(liang)的(de)(de)1期(qi)臨床(chuang)試驗(yan)中(zhong)(zhong)，僅在(zai)最(zui)高12µg劑量(liang)下發(fa)現達到恢(hui)復(fu)期(qi)血清水平的(de)(de)中(zhong)(zhong)和(he)滴度(du)(du)，導致正在(zai)進行的(de)(de)2期(qi)試驗(yan)納入(ru)更高劑量(liang)16和(he)20µg[52]。接受(shou)12µg劑量(liang)的(de)(de)所有(you)患者(zhe)在(zai)每(mei)次給藥(yao)后均發(fa)生(sheng)(sheng)全身不良(liang)事件(jian)，大多(duo)數為中(zhong)(zhong)度(du)(du)和(he)重(zhong)度(du)(du)，而 > 80%的(de)(de)患者(zhe)在(zai)輕度(du)(du)和(he)中(zhong)(zhong)度(du)(du)水平發(fa)生(sheng)(sheng)局(ju)部注射(she)部位疼痛。

5.4. TranslateBio

Translate Bio使(shi)用(yong)非修(xiu)飾(shi)的(de)mRNA編碼雙突(tu)變形式的(de)二脯氨(an)酸(suan)穩定的(de)刺突(tu)蛋白(bai)，并通過被引(yin)用(yong)為基于可(ke)電離脂(zhi)質(zhi)C12-200[109]的(de)LNP進(jin)行遞送，其可(ke)能是最近從ICE-[110]或(huo)基于半胱氨(an)酸(suan)的(de)[55]可(ke)電離脂(zhi)質(zhi)家(jia)族(zu)合(he)成的(de)候選物(wu)。在(zai)Balb/c小鼠中(zhong)，0.2–10µg范圍內的(de)兩次給藥(yao)導致結合(he)和中(zhong)和滴(di)度遠高于恢復期(qi)水平(ping)。在(zai)非人靈長類動物(wu)中(zhong)，15、45和135µg劑量產生的(de)滴(di)度均(jun)超過人恢復期(qi)組[56]。免(mian)疫(yi)應答也存在(zai)Th1偏(pian)倚。

5.5. Arcturus

Arcturus使用(yong)(yong)自(zi)擴增(zeng)(zeng)、全長(chang)、未修(xiu)飾的(de)mRNA編碼(ma)融合前SARS-CoV-2全長(chang)刺突蛋白，通過LNP進行(xing)遞送，該LNP使用(yong)(yong)可(ke)電離脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)與硫酯(zhi)，通過兩個額外的(de)酯(zhi)基將含胺的(de)頭基與脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)尾(wei)部連接。該家族中兩種(zhong)可(ke)能的(de)可(ke)電離脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)是脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)10a（[111]的(de)表(biao)4）或脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)2,2(8,8)4 C CH3（[57]的(de)第33頁）（表(biao)2）。后者有三個分支，類似于(yu)Moderna Lipid H，但有一(yi)個可(ke)降解(jie)的(de)硫酯(zhi)與頭基連接。觀察到自(zi)身擴增(zeng)(zeng)mRNA的(de)特征，即IM給藥后1周(zhou)以上，熒光素酶報告基因表(biao)達維(wei)持在相當恒定(ding)的(de)水平，而(er)常規mRNA表(biao)達迅(xun)速下降[58]。

單(dan)(dan)獨接(jie)種疫(yi)苗在C57BL/6小(xiao)鼠(shu)中(zhong)產生了(le)令人驚(jing)訝地體重減(jian)輕和臨(lin)床(chuang)評分增加。小(xiao)鼠(shu)中(zhong)僅需要(yao)2µg或(huo)10µg（而非0.2µg）單(dan)(dan)次給藥，即可(ke)在Th1偏(pian)倚應答中(zhong)達(da)到高于100的(de)中(zhong)和滴(di)(di)度，并具有高水平的(de)抗原特異性T細胞應答。在K18-hACE2致死小(xiao)鼠(shu)激(ji)發模型中(zhong)，2µg或(huo)10µg單(dan)(dan)次給藥也具有100%保(bao)護作用，100%存活(huo)，無(wu)體重減(jian)輕，肺(fei)和腦(nao)病毒滴(di)(di)度降低至基線(xian)水平。Arcturus已經完成了(le)1期臨(lin)床(chuang)試驗(yan)(yan)，劑量為(wei)1-10µg，并選擇7.5µg進(jin)行3期試驗(yan)(yan)[112]。

5.6.帝國理(li)工學院

倫敦帝國理(li)工學院使用(yong)Acuitas LNP遞送的(de)自擴增mRNA編(bian)碼的(de)融合前穩定的(de)刺突(tu)蛋白(bai)，該(gai)LNP在Lipid A9[60]代表的(de)專利[59]中進(jin)行了描(miao)述(shu)（表2）。在Balb/c小鼠兩次注(zhu)射0.01µg至10µg劑(ji)(ji)(ji)量(liang)(liang)范圍后，獲(huo)得了較(jiao)高(gao)的(de)劑(ji)(ji)(ji)量(liang)(liang)依賴性(xing)抗體和中和滴度(du)。該(gai)應答存在強烈的(de)Th1偏倚，與較(jiao)低的(de)0.1和0.01µg劑(ji)(ji)(ji)量(liang)(liang)相比，10和1µg劑(ji)(ji)(ji)量(liang)(liang)產(chan)生的(de)抗原(yuan)特(te)異性(xing)脾細胞應答高(gao)3倍。這(zhe)種疫苗的(de)1期臨床試(shi)驗即將開始。

5.7.朱(zhu)拉隆功大學、賓夕法尼(ni)亞大學

朱拉(la)隆(long)功大學與賓夕(xi)法尼亞大學合作，正在使用Genevant LNP（可能(neng)是CL1脂(zhi)質）開(kai)發一種天然的加標免(mian)疫原(yuan)核苷修飾的mRNA LNP[61]。他們的目標是在2021年第(di)1季度(du)開(kai)始1期臨床(chuang)試驗(yan)，并(bing)在2021年第(di)4季度(du)開(kai)始將疫苗分發給泰國和(he)7個周圍的低至(zhi)中(zhong)等收(shou)入國家。

5.8. Providence Therapeutics

Providence Therapeutics被授予加(jia)拿大衛生(sheng)部許(xu)可(ke)進行(xing)(xing)PTX-COVID-19B mRNA LNP疫(yi)苗(miao)人體臨(lin)床試驗的(de)通知[113]。C57BL6小鼠(shu)按(an)照初免-加(jia)強免疫(yi)方案接受20µg劑量給藥(yao)后，對(dui)編碼受體結(jie)合域（furin裂解位點有(you)或(huo)無突變的(de)全(quan)長加(jia)標物(wu)）的(de)三種mRNA候(hou)選物(wu)進行(xing)(xing)臨(lin)床前(qian)研究[114]。來(lai)自(zi)Genevant未披露脂質的(de)臨(lin)床前(qian)數據結(jie)果（可(ke)能與表2中的(de)CL1相似）顯示出對(dui)于全(quan)長和furin突變有(you)效負(fu)載的(de)穩(wen)健中和滴(di)度，與[115]中觀察到(dao)的(de)數據相似。1期臨(lin)床試驗計劃于2021年(nian)第一季度開始，疫(yi)苗(miao)的(de)生(sheng)產和分銷(xiao)——等待監管批(pi)準(zhun)——在(zai)同(tong)年(nian)進行(xing)(xing)。

5.9.儲存和分銷(xiao)

大(da)多數在(zai)實驗(yan)室中制造的(de)(de)(de)RNA LNPs在(zai)4 °C下(xia)可穩定數天(tian)，但隨后(hou)表(biao)現(xian)出體(ti)積增大(da)和生(sheng)物活(huo)性逐漸喪(sang)失，如熒光(guang)素酶(mei)表(biao)達[116]。在(zai)之前(qian)的(de)(de)(de)siRNA LNP制劑(ji)中，通(tong)常(chang)觀察到LNP聚集的(de)(de)(de)大(da)小隨時間(jian)增加[117]。為了穩定用于儲(chu)存(cun)和分銷的(de)(de)(de)mRNA LNP疫苗(miao)，迄今(jin)為止需(xu)要(yao)冷凍形(xing)式。Moderna COVID-19疫苗(miao)需(xu)要(yao)在(zai)-25 ℃～-15 ℃保存(cun)，但在(zai)2 ℃～8 ℃之間(jian)也可穩定長(chang)達30天(tian)，在(zai)8 ℃～25 ℃之間(jian)可穩定長(chang)達12 h[118]。輝瑞(rui)/BioNTech COVID-19疫苗(miao)需(xu)要(yao)在(zai)-80 ℃至-60 ℃下(xia)儲(chu)存(cun)，然后(hou)解凍并在(zai)2 ℃至8 ℃下(xia)儲(chu)存(cun)長(chang)達5天(tian)，然后(hou)在(zai)注射(she)前(qian)用生(sheng)理鹽水稀釋[119]。

與Moderna疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)所需(xu)的(de)常(chang)規冷凍(dong)(dong)溫度(du)相比，輝(hui)瑞疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)在分(fen)(fen)銷和儲存期間所需(xu)的(de)干(gan)冰溫度(du)更難達到。這些溫差背(bei)后的(de)原因并(bing)不(bu)明顯，因為兩種疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)均含有(you)相似的(de)高濃度(du)蔗糖作為冷凍(dong)(dong)保護劑。Moderna mRNA LNPs在Tris和醋酸鹽兩種緩沖(chong)液中冷凍(dong)(dong)[41]，而Pfizer/BioNTech疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)僅使用磷酸鹽緩沖(chong)液[40]。已知磷酸鹽緩沖(chong)液對冷凍(dong)(dong)不(bu)理(li)想，因為其易于沉淀，并(bing)在冰結晶(jing)開始時引起pH值突然變化[120,121]。凍(dong)(dong)干(gan)對于mRNA LNPs一直具(ju)有(you)挑戰性[116]。然而，Arcturus表(biao)示(shi)，他們的(de)COVID-19 mRNA疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)在凍(dong)(dong)干(gan)形式下(xia)是(shi)穩定的(de)，這大概會大大簡(jian)化分(fen)(fen)布，盡管這種凍(dong)(dong)干(gan)制劑的(de)溫度(du)穩定性尚未(wei)披露[122]。

原文(wen)來(lai)源：Automated Manufacture of Autologous CD19 CAR-T Cells for Treatment of Non-hodgkin Lymphoma.Front.Immunol.11:1941. DOI:10.3389/fimmu.2020.01941